二氫槲皮素與二氫楊梅素抗炎活性對比研究

王佳奇，陳凱，王月亮，李瑩，劉一桐，高銘彤，李靖毓，丁傳波，宋明銘，劉文叢

(吉林農業大學中藥材學院, 長春 130118)

二氫槲皮素與二氫楊梅素抗炎活性對比研究

王佳奇，陳凱，王月亮，李瑩，劉一桐，高銘彤，李靖毓，丁傳波，宋明銘，劉文叢*

(吉林農業大學中藥材學院, 長春 130118)

構建巨噬細胞驗證模型，比較研究二氫槲皮素(Dihydroquercetin,taxifolin, TF)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DMY)體外抗炎活性。以1 mg/L的脂多糖(LPS)誘導RAW264.7巨噬細胞建立了體外炎癥模型；通過細胞毒性試驗(MTT)法檢測細胞存活率；Griess試劑法測定細胞上清液中NO(一氧化氮)釋放量；ELISA法檢測上清液中細胞因子IL-1β(白細胞介素-1β)、IL-6(白細胞介素-6)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)和PGE2(前列腺素E2)的含量變化；通過RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達情況。MTT試驗結果表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素各劑量組沒有表現出對巨噬細胞RAW264.7的細胞毒性。同時，二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組均能顯著抑制脂多糖誘導細胞對NO、PGE2的釋放(P<0.01)，且均表現出劑量依賴性；二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組均能有效降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因的表達，同時能夠降低脂多糖誘導細胞產生細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。二氫槲皮素和二氫楊梅素均具有良好的體外抗炎作用，且二氫槲皮素的抗炎作用較好。

二氫槲皮素；二氫楊梅素；RAW264.7細胞；炎癥

二氫槲皮素和二氫楊梅素是兩種典型的類黃酮化合物，它們有相似的母體結構，其差別僅為B環5’位上是否存在酚羥基。它們的結構如圖1所示。目前，體外抗炎作用一般多以脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型，然后通過測定用藥前后炎癥因子含量的變化以及相關基因的表達量研究藥物的抗炎活性。有研究表明[1-3]，二氫槲皮素(taxifolin, TF)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DMY)均具有抗炎活性，對一些炎癥模型均體現出良好的抗炎效果。但目前就市場價格，二氫槲皮素非常昂貴，是二氫楊梅素的10倍，本實驗以二氫槲皮素和二氫楊梅素作為研究對象，將兩種類黃酮化合物的抗炎活性進行對比研究，旨在為抗炎藥物的開發利用提供依據。

圖1 二氫楊梅素和二氫槲皮素化學結構圖

1 材料與方法

1.1 材料 二氫槲皮素(TF) HPLC>97%，實驗室自制；二氫楊梅素(DMY),HPLC>98%，批號：K140511, 西安開來生物工程有限公司。小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 試劑及儀器 地塞米松(Dexamethasone，DXM)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS), Sigma；二甲基噻唑(MTT)， Amresco；二甲基亞砜(DMSO)，Sigma；青鏈雙抗，Gibco；DMEM高糖培養基，hyclone；小牛血清，hyclone；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫分析試劑盒，小鼠白介素-6(IL-6)酶聯免疫分析試劑盒，小鼠白介素-1β(IL-1β)酶聯免疫分析試劑盒，小鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯免疫試劑盒均購自R&D公司；蒸餾水(吉林農業大學)。

美國Costar 6孔和24孔細胞培養板; 美國Forma Scientific CO2細胞培養箱; 倒置顯微鏡(Olympas); 北京六一電泳儀；美國BIORAD 凝膠成像儀；美國SBP PCR儀；Haier -70 ℃低溫冰箱；美國Thermo Electron MK3型酶標儀。

1.3 細胞培養 小鼠巨噬細胞RAW264.7培養于DMEM培養基中, 內含10%滅活新生小牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素, 置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度的培養箱中培養。

1.4 MTT法測定二氫槲皮素和二氫楊梅素毒性 取對數生長期的RAW264.7細胞至離心管內，調整細胞濃度為1×105個細胞/mL，以100 μL/孔的量鋪至96孔板中，于5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24 h。根據實驗要求，加入含不同濃度的TF(2.5,5,10,20,40 μg/mL)和DMY(2.5,5,10,20,40 μg/mL)DEME高糖培養液，每孔100 μL，空白組加入等體積的DMEM高糖培養液，培養24 h，每孔各做三個平行孔。在終止細胞培養前4 h，加入20 μL/孔MTT(5 mg/mL)。終止細胞培養后，輕輕吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩5 min，待甲瓚充分溶解，用酶標儀測定570 nm處的各孔吸光度，相對于空白組計算細胞存活率。

1.5 ELISA法檢測RAW264.7細胞培養上清液中細胞因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)和PGE2的水平 取對數生長期的RAW264.7細胞至離心管內，調整細胞濃度為1×105個細胞/mL，以500 μL/孔的量鋪至24孔板中，于5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24 h。實驗分為9組，即空白對照組，LPS模型組，陽性對照組，TF高、中、低劑量組和DMY高、中、低劑量組，每組設三個平行組。棄上清，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養液250 μL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養液250 μL，干預2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養液250 μL，培養24 h。培養結束時，吸取細胞上清液，上清液按照TNF-α，IL-6，IL-1β和PGE2酶聯免疫檢測試劑盒說明書測定其中TNF-α，IL-6，IL-1β和PGE2的水平。

1.6 NO的檢測 取對數生長期的RAW264.7細胞至離心管內，調整細胞濃度為1×105個細胞/mL，以500 μL/孔的量鋪至24孔板中，于5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24 h。實驗分為9組，即空白對照組，LPS模型組，陽性對照組，TF高、中、低劑量組和DMY高、中、低劑量組。棄上清，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養液250 μL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養液250 μL，干預2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養液250 μL，培養24 h。培養結束時，吸取培養液100 μL于另一96孔細胞培養板，每孔各加入100 μL Griess reagent 試劑(1% sulfanilamide 和0.1% N-[1-naphthyl]- ethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid)，室溫避光放置10 min，于540 nm處測定OD值。

1.7 RT-PCR檢測TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA的表達 取對數生長期的RAW264.7細胞至離心管內，調整細胞濃度為4×105個細胞/mL，將細胞以2 mL/孔的量接種于6孔板中，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h后棄除培養液，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養液2 mL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養液2 mL，干預2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養液2 mL，培養24 h。去除細胞上清液，用PBS洗滌細胞兩次，然后利用高純總RNA快速提取試劑盒提取細胞中RNA,取1 μg總RNA配置逆轉錄反應體系，逆轉錄合成cDNA，并以此為模板利用Bio Teke super RT Kit試劑盒進行擴增。PCR反應中使用的引物序列如表1所示。PCR擴增產物10 μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，運用數碼凝膠成像分析系統拍照，成像觀察。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 二氫槲皮素及二氫楊梅素的細胞毒性評價 選取藥物濃度為2.5～40 μg/mL的二氫槲皮素和二氫楊梅素分別作用于RAW264.7細胞24 h，采用MTT法測得不同濃度的TF和DMY對小鼠RAW264.7細胞是否具有毒性作用，從而確定使用劑量。如圖2所示，藥物濃度在2.5～20 μg/mL內的TF組和DMY組與空白組相比，細胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，結果表明TF在2.5～20 μg/mL，DMY在2.5～20 μg/mL范圍內對小鼠RAW264.7細胞沒有細胞毒性作用。

圖2 TF和DMY對小鼠RAW264.8細胞活力的影響(*P<0.05，**P<0.01與空白對照組比較)

2.2 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞釋放炎癥介質NO、PGE2的影響 由表2可知，LPS模型組NO、PGE2含量與空白組相比均顯著升高。TF和DMY各劑量組對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞釋放NO、PGE2均具有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性關系。TF高劑量組的NO含量與陽性對照組相比無顯著性差異。

表2 TF和DMY對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放炎癥介質NO、PGE2的影響

注：##P<0.01與空白對照組比較；**P<0.01與LPS組比較；△△P<0.01與陽性對照組比較

2.3 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞分泌細胞因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)的影響 與空白對照組相比，LPS模型組細胞因子含量均顯著升高。與LPS模型組相比，TF和DMY各劑量組對炎癥模型細胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量均顯著性降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌的水平逐漸降低，呈劑量依賴性關系。TF高劑量組的細胞因子IL-6含量，與陽性對照組相比無顯著性差異(表3)。

表3 TF和DMY對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響

##P<0.01與空白對照組比較；**P<0.01與LPS組比較；△P<0.05、△△P<0.01與陽性對照組比較

2.4 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞基因TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達的影響 試驗結果表明(圖3)，LPS構建巨噬細胞驗證模型導致細胞中TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達量提高，由于這三種細胞因子是炎癥反應中的關鍵標志物，因此通過PCR鑒定驗證成功構建了炎癥模型。地塞米松通過抑制細胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β 基因的表達而表現出了對炎癥反應的抑制作用。相比之下，二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組對TNF-α，IL-6和IL-1β基因表達也分別表現出了不同的抑制作用，其中二氫槲皮素高劑量組對三種細胞因子的基因表達量的抑制作用最為明顯。

A:空白對照組 B：LPS模型組 C：陽性對照組 D～E：二氫槲皮素低劑量組(5mg/L)、中劑量組(10 mg/L)、高劑量組(20 mg/L) G～I:二氫楊梅素低劑量組(5 mg/L)、中劑量組(10 mg/L)、高劑量組(20 mg/L)圖3 TF和DMY對LPS誘導的RAW264.7細胞基因TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達的影響

3 討論與小結

炎癥是指機體受到了自身及外界損害或者處于應激狀態時，呈現的以快速動力循環、快速代謝反應為特征的生理及病理過程。在多數的細胞和動物實驗中常用脂多糖誘導炎癥發生[4-7]。巨噬細胞會在炎癥啟動的過程中通過激活機體自身的免疫系統，釋放具有生物活性的酯類介質、細胞因子及活性氧等炎癥介質起著至關重要的作用[8-9]。

3.1 二氫槲皮素及二氫楊梅素的細胞毒性評價 本實驗以脂多糖(LPS)誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞為模型，將二氫槲皮素和二氫楊梅素的體外抗炎活性進行對比。首先采用MTT法檢測了二氫槲皮素和二氫楊梅素對小鼠RAW264.7巨噬細胞的細胞毒性影響。結果顯示，藥物濃度在2.5～20 μg/mL內的二氫槲皮素組和二氫楊梅素組與空白組相比，細胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，結果表明二氫槲皮素在2.5～20 μg/mL，二氫楊梅素在2.5～20 μg/mL范圍內對小鼠RAW264.7細胞沒有細胞毒性作用。有研究證實，醫學上將選擇性調節細胞因子表達水平的方法用于炎癥疾病治療[10-11]，因而只要可以增加抗炎細胞因子分泌或抑制促炎細胞因子表達的藥物均可用于治療炎性疾病。

3.2 二氫槲皮素及二氫楊梅素對炎癥介質的影響 在炎癥發生的過程中，參與介導炎癥反應，具有調節作用的內源性化學因子稱為炎癥介質。在這些炎癥介質中，有兩種主要的炎癥介質共同參與了機體的抗炎反應，即NO和PGE2。一氧化氮(NO)主要是由誘生性一氧化氮合酶(iNOS)催化生成的，當機體受到某些因素(TNF、LPS等)刺激時，iNOS蛋白大量合成，導致大量NO釋放，從而對機體產生影響。有研究發現，膿毒血癥和急慢性炎癥的發生都與NO有關[12-13]，而極微量的PGE2就可以對機體引發炎性反應[14-16]。本實驗通過對細胞培養液中NO和PGE2的含量檢測發現：與空白對照組相比，LPS對照組NO和PGE2分泌量顯著增加；與LPS對照組相比，二氫槲皮素和二氫楊梅素各劑量組對LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞釋放NO和PGE2均具有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性關系。因此可推想二氫槲皮素和二氫楊梅素的抗炎作用大概與其抑制PGE2和NO的合成相關。

3.3 二氫槲皮素及二氫楊梅素對炎癥因子的影響 當機體被LPS刺激后，體內巨噬細胞會分泌出大量細胞因子。其中抗炎因子TNF-α在整個炎癥反應進程中起到最為關鍵的作用。TNF-α可以誘導IL-6、IL-1β等細胞因子的產生和釋放[17-18]，從而啟動細胞因子級聯反應[19]，增強血管通透性。白細胞介素-1β(IL-1β)作為IL-1基因家族的一員，可由LPS刺激直接產生，也可以通過TNF-α誘導產生，是一種具有廣泛調節作用的促炎因子，誘導TNF、IL-6及其自身分泌，并同TNF互相促進彼此釋放。此外，LPS誘導產生的發熱反應與炎癥的主要誘發者IL-6有密切關系。當機體因炎癥感染初期，血液中IL-6表達量一般會相對較高，然而當血液中IL-6的表達量持續增高，便會對機體形成重大的損害，如燒傷、器官衰竭等[20]。因此阻斷炎癥反應持續發展的核心就是通過約束這些細胞因子的過度表達，恢復細胞因子網絡的平衡狀態。通過對細胞上清液中細胞因子含量的檢測結果顯示，當小鼠RAW264.7細胞被LPS刺激后， LPS組的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量與空白對照組相比顯著升高，說明體外炎癥模型造模成功。與LPS模型組相比，TF和DMY各劑量組對炎癥模型細胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量均顯著性降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌的水平逐漸降低，呈劑量依賴性關系。TF高劑量組的細胞因子IL-6含量，與陽性對照組相比無顯著性差異。結果表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素可以通過抑制炎癥細胞因子的釋放起到抗炎作用。

綜上所述，二氫槲皮素和二氫楊梅素均可呈劑量依賴性的抑制LPS刺激的小鼠RAW264.7細胞釋放炎癥介質NO、PGE2，并且降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因的表達，阻礙分泌細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，起到抗炎作用。通過對比發現，二氫槲皮素比二氫楊梅素抗炎活性更好，但對它們的抗炎的作用機理需要進行更加深入的研究，從而為抗炎藥物的開發利用提供依據。

[1] Zhu Hong, Tang Sheng-an, Qin Nan,etal. Anti-inflammatory constituents from Inula japonica [J]. China Journal of Chinese Materia, 2014, 39(1):83-88.

[2] 梁婷.二氫楊梅素抗炎及抗過敏作用的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學,2007.

[3] 陳立峰, 董倩倩,張瓊.二氫楊梅素對大鼠免疫性慢性胃炎胃粘膜的保護作用及其機制[J]. 中國藥理學與毒理學雜志,2009,23(5):381-387.

[4] 李景,吳陽陽,周海松,等.青藤堿對細菌內毒素刺激的小鼠及巨噬細胞嘌呤受體A2A、P2X7表達的影響[J].廣州中醫藥大學學報,2016,33(1):97-102.

[5] 平舜,王凱,張江臨,等.茶蜂花粉提取物BPE對LPS誘導的Raw264.7細胞的體外抗炎癥作用[J].食品與生物技術學報,2015,34(12):1302-1307.

[6] 戴藝,徐明生,上官新晨,等.綠原酸對小鼠腹腔巨噬細胞免疫調節作用的研究[J].天然產物研究與開發,2015(27):2128-2133.[7] 謝斌,吳蓓,歐陽輝,等.杏香兔耳風中5種單體對LPS誘導RAW264.7細胞內NO生成的影響[J].2015,46(12):60-62.

[8] Kim M M，Kim S K. Effect of phloroglucinol on oxidative stress and inflammation [J]. Food Chem Toxicol, 2010,48(10):2925-2933.[9] Kim S, Jung E, Kim J H,etal. Inhibitory effects of (-)-α-bisabolol on LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages[J]. Food Chem Toxicol, 2011, 49(10):2580-2585.

[10]Takeuchi O, Sato S, HoriuchiT,etal. Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins [J]. J Immun, 2002, 169(1):10-14.

[11]Su H, Bidere N, Zheng L,etal. Requirement for caspase-8 in NF-kappaB activation by antigen receptor[J]. Science, 2005, 307(5714):1465-1468.[12]Cerny O, Kamanova J, Masin J,etal. Bordetella pertussis Adenylate Cyclase Toxin Blocks Induction of Bactericidal Nitric Oxide in Macrophages through cAMP-Dependent Activation of the SHP-1 Phosphatase [J]. J Immunol, 2015, 195(10):4901-4913.

[13]Lee K J, Yeo M G. Homeopathic Rhus toxicodendron has dual effects on the inflammatory response in the mouse preosteoblastic cell line MC3T3-e1[J]. Homeopathy, 2016, 105(1):42-47.

[14]Shi R, Wang Q, Ouyang Y,etal. Picfeltarraenin IA inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine production by the nuclear factor-kB pathway in human pulmonary epithelial A549 cells[J]. Oncol Lett, 2016, 11(2):1195-1200.

[15]Tursun X, Zhao Y, Alat Z,etal. Anti-Inflammatory Effect of Rose rugosa Flower Extract in Lipopolysaccharide-Stimulated RAW264.7 Macrophages [J]. Biomol Ther(Seoul), 2016, 24(2):184-190.

[16]Jung Y Y, Hong J T, Han S B,etal. Effect of lxeris dentata Nakai Extract on Nitric Oxide Production and Prostaglandin E2 Generation

in LPS-stimulated RAW264.7 Cells [J]. Immune Netw, 2015, 15(6):325-330.

[17]Alizan A, Khalil J. Tumour Necrosis Factor: Implications forsurgical patients [J]. ANZ J Surg, 2006, 76(11):1010-1016.

[18]Tom L, Christian T. Intracellular survival pathways in the liver [J]. Liver International, 2006, 26(10):1163-1174.

[19]Wouter M, Kooloos D J. Potential role of pharmacogentics in anti-TNF treatment of rheumatoid arthritis and crohn’s disease [J]. Drug Discovery Today, 2007, 12(3/4):125-131.

[20]Park W Y, Goodman R B, Steinberg K P,etal. Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome [J]. AmJ Respir Crit Care Med, 2001, 164(10):1896-1903.

(編輯：侯向輝)

Comparison of Anti-inflammatory Activity of Dihydroquercetin and Dihydromyricetin

WANG Jia-qi, CHEN Kai, WANG Yue-liang, LI Ying, LIU Yi-tong, GAO Ming-tong,LI Jing-yu, DING Chuan-bo, SONG Ming-ming, LIU Wen-cong*

(CollegeofTraditionalChineseMedicine,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Construction of macrophages to validate the model, comparative study dihydroquercetin(also known as taxifolin, TF) and dihydromyricetin(DMY)invitroanti-inflammatory activity was made. To 1 mg/L lip polysaccharide (LPS) - induced RAW264.7 macrophagesinvitromodel of inflammation was established；Cell viability was detected by the cytotoxicity test (MTT) method；Griess reagent method was used to determine the amount of NO released from cell supernatant；The content of cytokine IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2in supernatant was detected by ELISA assay; Gene expression were detected with the methods of RT-PCR. TF and DMY 2.5～20 μg/mL showed no cytotoxicity on macrophages of RAW264.7. Meanwhile, TF high, medium and low dose group and DMY high, medium and low dose group significantly inhibited LPS-induced cells to release of NO and PGE2(P<0.01), and showed a dose-dependent manner; TF high, medium and low dose group and DMY high, medium and low dose group could effectively reduce IL-1β, IL-6, TNF-α gene expression, while reducing LPS-induced cells to produce cytokines levels. Dihydroquercetin and DMY have good anti-inflammatory effectsinvitroand anti-inflammatory effect of TF was better.

dihydroquercetin; dihydromyricetin; RAW264.7 cells; inflammation

科技型中小企業創新創業基金項目(20160308002YY)

王佳奇，碩士研究生，從事中藥新藥研究與開發。

劉文叢。E-mail：jwlw6803@126.com

2016-05-13

A

1002-1280 (2016) 07-0046-07

S859.796