大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清的制備

張媛，劉博，王秀麗，張磊，李建，彭國瑞，辛凌翔，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清的制備

張媛，劉博，王秀麗，張磊，李建，彭國瑞，辛凌翔，蔣玉文*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研制大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清，以大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)為菌種制備抗原免疫家兔，獲得了定型原血清，并通過比較不同免疫程序及劑量優(yōu)化了定型原血清的制備工藝。進而按照優(yōu)化后的定型原血清制備工藝，以大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)為菌種制備抗原免疫家兔，獲得了10種O抗原型定型原血清。將定型原血清分別與180種微量凝集試驗抗原逐一反應，明確各原血清與非特異性抗原的交叉凝集價，通過用吸收抗原對原血清進行吸收及稀釋的方法消除非特異性凝集，最終制備成大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清。血清質量評價結果表明，新制備的單因子定型血清性狀為無色、淡黃色或黃色澄明液體，個別有少量絮狀物；無菌生長；特異性良好；凝集效價為1︰2。研究結果顯示，制備的大腸桿菌O抗原單因子定型血清具有較好的特異性，可以用于對臨床分離大腸桿菌進行O抗原血清型鑒定。

大腸桿菌；菌體抗原；單因子血清

大腸桿菌病是一類重要的人畜共患病，每一株大腸桿菌只具有單一菌體抗原型(O抗原型)，其O抗原型與菌株致病性相關，多項關于致病性大腸桿菌檢測的國家標準及行業(yè)標準中都要求對其O抗原進行血清學凝集試驗，以確定其O抗原型[1-2]。目前丹麥國家血清研究院(SSI)等國外研究機構可提供大腸桿菌O抗原單因子定型血清，但由于其血清產品在國內售價昂貴限制了應用。尤其是在獸醫(yī)領域進行動物源大腸桿菌O抗原型的鑒定，廣大獸醫(yī)工作者仍是使用國內的血清產品[3-6]。但是，現今國內相關產品由于制備工藝粗糙，產品質量與國外血清仍有較大差距，用國內血清往往鑒定不出菌株的單一血清型，以致目前許多養(yǎng)殖場及獸醫(yī)科研機構面臨著國內血清定不出型，國外血清買不起的尷尬局面。本課題組擬改進大腸桿菌O抗原定型血清制備工藝，制備出可達到國外同類產品水平的定型血清。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供；大腸桿菌臨床分離菌株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細菌制品檢測室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通肉湯、普通瓊脂、硫乙醇酸鹽、酪胨、葡萄糖蛋白胨湯，購自北京中海動物保健科技公司。

1.1.3 試劑 大腸桿菌O抗原定型血清、180種大腸桿菌菌體微量凝集試驗抗原，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細菌制品檢測室提供；大腸桿菌O抗原單因子定型血清，購自丹麥國家血清研究院(SSI)；206佐劑，由金宇保靈生物藥品有限公司惠贈；含0.5%石碳酸生理鹽水，購自北京中海動物保健科技公司。

1.1.4 實驗動物 健康家兔，1.5～2.0 kg，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.5 主要儀器設備 GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器購自太倉市實驗設備廠；Herasafe KS生物安全柜購自德國Heraeus公司；離心機購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法 本試驗利用大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)制備免疫抗原，開展了免疫程序的研究，明確了定型原血清制備工藝。進而按照定型原血清制備工藝，以大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)為菌種制備免疫抗原免疫家兔，制備了10種定型原血清。將定型原血清分別與180種微量凝集試驗抗原逐一反應，明確各原血清與非特異性抗原的交叉凝集價，通過制備吸收抗原對血清進行吸收及稀釋的方法消除非特異性凝集，制備成大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清。并對新制備的血清進行了質量評價，具體試驗方法如下：1.2.1 抗原濃度的確定 將大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基復壯后，劃線接種普通瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)20 h后，取單菌落接種普通肉湯100 mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h后，通過活菌計數計算菌液濃度。每株菌均制備3批菌液，通過計算3株菌共9批菌液的濃度對數值的平均值及標準差確定抗原濃度。

1.2.2 抗血清的制備 免疫抗原的制備：將大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌種制備的菌液的濃度調整至確定的抗原濃度范圍內，121 ℃高壓1 h，待其恢復室溫后，按0.1%加入甲醛溶液，置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ妥魟┛乖闹苽洌好庖呖乖c206佐劑按1∶1(V/V)進行乳化后置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ庖叱绦虻膬?yōu)化：每種抗原免疫8只健康非免兔，免疫前采血，分離血清，將血清與180種反應抗原進行微量凝集試驗，反應體系為80 μL血清+80 μL抗原，反應條件為51±1 ℃過夜。由于與180種抗原反應需要約15 mL血清，為了不影響兔體健康狀況，每只兔僅采集少量血液，提取的血清進行16倍稀釋后再與抗原反應。而后將8只兔隨機分為2組，4只/組，其中第1組耳靜脈注射免疫抗原，免疫5次，每次間隔7 d，首免劑量為1 mL/只，以后逐次遞增1 mL，每次注射后第7天采血，分離血清，將血清進行16倍稀釋后測血清效價；第2組皮下注射油佐劑抗原兩次，間隔21 d，第1次免疫1 mL/只，第2次免疫2 mL/只，第2次免疫后第14天起按照與第1組相同的免疫程序用免疫抗原進行靜脈注射，分別于第1次免疫后7 d、14 d、21 d、第2次免疫后7 d、14 d及每次注射免疫抗原后第7天采血，分離血清，將血清進行16倍稀釋后測血清效價。分別計算每組4只兔血清效價的幾何平均值，確定定型血清制備的免疫程序。

1.2.3 制備10種定型原血清 按照定型原血清制備工藝制備。

1.2.4 定型原血清交叉凝集素及交叉凝集效價的測定 使用U底96孔板將O1、O2、O7、O64、O74、O100、O103、O116、O128、O154 10種未進行稀釋的定型原血清分別與180種反應抗原進行微量凝集試驗。孔底出現白色扣狀沉積為陰性，即血清與抗原不凝集；反之，未出現白色扣狀沉積為陽性，即血清與抗原凝集；若孔底白色扣狀沉積與凝集顆粒同時出現，結果判為可疑。將與多于60種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的原血清淘汰，測定剩余原血清與非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的效價。在U底96孔板的第1列每孔中加入血清原液160 μL，其余列每孔中加入含0.5 %石碳酸生理鹽水80 μL，然后從第1列吸出80 μl血清加入第2列中進行對倍稀釋，混勻后再從第2列吸出80 μL加入第3列中，以此方法進行對倍系列稀釋至第11列，即稀釋210倍，從第11列中吸出80 μL棄去。第12列作為抗原對照。在每行的12個孔中加入與之發(fā)生非特異性凝集的抗原80 μL，振蕩均勻后蓋上板蓋，放置于濕盒中，于51 ℃反應過夜。反應完成后，取出96孔板，對光觀察結果。以出現陽性反應的血清最高稀釋倍數作為定型原血清與非特異性抗原的交叉凝集價。

1.2.5 定型原血清交叉凝集素的吸收 選用交叉凝集價最高的非特異性抗原的生產菌株制備吸收抗原。取凍干菌種分別接種普通肉湯10 mL復蘇，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，再各劃線接種普通瓊脂平板2付，37 ℃培養(yǎng)20 h。從平板上挑取光滑圓整菌落分別密集劃線接種普通瓊脂中管斜面數支，37 ℃培養(yǎng) 24 h。每支中管斜面培養(yǎng)物用3 mL 0.5 %石炭酸生理鹽水洗下，分別混合置分裝瓶中，121 ℃高壓1 h后作為吸收抗原，待其恢復室溫后置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩⒋昭逵?.5 %石炭酸生理鹽水進行5倍稀釋后，按20 %(V/V)加入吸收抗原，置37 ℃ 200 r/min吸收3 h，然后置2～8 ℃繼續(xù)吸收24 h，3000 r/min離心15 min后吸取上清，作為待檢血清。取80 μL待檢血清與80 μL非特異性抗原通過微量凝集試驗方法，測定待檢血清與非特異性抗原的交叉凝集情況，若非特異性交叉凝集情況已完全消除，則該血清為單因子血清；若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，但凝集價遠遠低于其與特異性抗原的凝集價，則將血清進行適當稀釋至非特異性交叉凝集情況完全消除；若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，且凝集價和血清與特異性抗原的凝集價很接近，則需再次選取吸收抗原并再次進行交叉凝集素的吸收，直至制備出單因子血清。將制備好的單因子血清效價稀釋至1︰2，過濾除菌后進行無菌檢驗[7]。檢驗合格的血清定量分裝至玻璃瓶中，1 mL/瓶，置2～8 ℃保存。

1.2.6 單因子血清質量檢驗 常規(guī)方法進行性狀及無菌檢驗[7]。采用微量凝集試驗方法進行特異性檢查及效價測定。

1.2.7 鑒定臨床分離菌株血清型 用原有庫存定型血清、新制備的單因子定型血清、丹麥國家血清研究院生產的單因子定型血清同時對6株E.coli臨床分離菌株進行O抗原血清型鑒定。原有庫存定型血清采用平板凝集與試管凝集相結合的方法；新制備的單因子定型血清與丹麥國家血清研究院生產的單因子定型血清采用微量凝集試驗方法。

2 結果

2.1 抗原濃度的確定 3株大腸桿菌制備的9批菌液的濃度對數值的平均值為9.902，標準差為0.112，因此，抗原濃度確定為6.2×109～1.0×1010CFU/mL(表1)。

表1 大腸桿菌菌液活菌計數結果

2.2 免疫前后家兔血清效價檢測結果 免疫前24只家兔血清16倍稀釋液與180種反應抗原均不凝集。僅注射免疫抗原及先用油佐劑抗原免疫再注射免疫抗原兩種免疫程序制備的血清效價差異不明顯，但僅注射免疫抗原免疫周期僅為35 d，而先注射油佐劑抗原再注射免疫抗原的免疫周期需要70 d，況且免疫抗原靜脈免疫4次后，血清效價即可滿足生產需要(表2)。

表2 免疫后家兔血清效價幾何平均值

免疫程序Ⅰ為僅注射免疫抗原；免疫程序Ⅱ為先注射油佐劑抗原再注射免疫抗原；“/”表示未進行檢測；“-”表示血清與抗原不凝集

將凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)20 h，取肉湯培養(yǎng)物劃線接種普通瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)20 h，取單菌落接種普通肉湯100 mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h后，進行活菌計數。將菌液濃度調整至6.2×109～1.0×1010CFU/mL 范圍內，121 ℃高壓1 h，待其恢復室溫后，按0.1 %加入甲醛溶液，此為免疫抗原，置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩６夓o脈注射免疫抗原4次，免疫劑量分別為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL，每次免疫間隔7 d。最后一次免疫后第4天試血，若血清效價不低于1∶64對免疫兔進行心臟采血致死，提取血清；若血清效價低于1∶64，則用相同的抗原5 mL以相同的注射途徑加強免疫一次，并于加強免疫后第4天試血，若血清效價不低于1∶64則采血；若血清效價仍低于1∶64則淘汰該兔。

2.3 制備10種定型原血清 按照定型原血清制備工藝，每種抗原免疫2只家兔，免疫CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)及CVCC1442(O103)抗原的家兔各有1只在加強免疫后血清效價仍低于1∶64予以淘汰。制備了O1、O2、O7、O64、O74、O100、O103、O116、O128、O154共10個血清型的大腸桿菌菌體O抗原定型原血清。

2.4 定型原血清交叉凝集素及凝集價的測定 不同原血清與非特異性抗原交叉凝集情況不一，最少僅與1種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，而最多與168種抗原發(fā)生交叉凝集。即使同一抗原免疫不同家兔獲得的原血清與非特異性抗原的交叉凝集情況也不一致。將與多于60種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的原血清淘汰，測定剩余原血清與非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的效價(表3)。

表3 原血清與180種反應抗原微量凝集試驗結果

續(xù)表

加下劃線的抗原表示同一血清型的2份原血清共有的交叉凝集抗原；黑體突出顯示的抗原表示為吸收抗原

2.5 單因子定型血清的制備 采用吸收與稀釋相結合的方法制備了10種大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清(表4)。

表4 單因子定型血清制備

2.6 單因子血清質量檢驗 大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清性狀為無色、淡黃色或黃色澄明液體，個別有少量絮狀物；無菌生長；特異性良好；凝集效價為1∶2(表5)。

表5 單因子定型血清檢驗結果

2.7 鑒定臨床分離菌株血清型 用原有庫存血清對6株臨床分離菌株進行O抗原血清型鑒定，鑒定結果分別為O2和O74混合型、O103和O154混合型、O7和O116混合型、O1和O128混合型、O2和O64混合型、O100和O154混合型，用新制備的單因子定型血清和丹麥國家血清研究院生產的單因子定型血清對6株臨床分離菌株進行O抗原血清型鑒定，鑒定結果均為O2、O103、O116、O1、O2、O100(表6)，表明新制備的定型單因子血清可用于大腸桿菌的O抗原定型，并具有良好的特異性，定型結果與丹麥血清完全一致。

表6 臨床分離菌株O抗原血清型鑒定結果

3 討論

典型的脂多糖分子(lipopolysaccharide，LPS)由O特異性多糖鏈、核心多糖和類脂A三個部分共價連接而成。O特異性多糖鏈又稱O抗原多糖鏈，簡稱O抗原。O抗原結合在核心多糖上，位于脂多糖分子的最外層，是細菌細胞主要的表面抗原。O抗原由寡糖單位組成，每個重復單位通常由4～6個糖組成。這些糖通常為中性糖、氨基糖，有時為罕見的脫氧糖。單糖的不同，單糖數量的不同，單糖間鍵的不同，和寡糖單位之間聯接鍵的不同構成了多糖的多樣性[8]。大腸桿菌有180種不同結構的O抗原。O抗原構成革蘭氏陰性菌的菌體抗原，可以刺激機體產生特異性免疫反應。一般合成O抗原的基因成簇分布在細菌的基因組上，在大腸桿菌中O抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[9]。在O抗原基因簇中，一般含有三種基因：單糖合成酶基因，糖基轉移酶基因，寡糖單位處理酶基因。寡糖單位處理酶基因帶有特定的序基，或有特殊的拓撲結構，從而決定了O抗原定型血清的特異性。但是，單糖合成酶基因較高的同源性，又導致了不同型O抗原免疫動物制備的抗血清間存在交叉凝集[10]。本研究對臨床分離菌株O抗原血清型鑒定時，使用了原有庫存血清、新制血清和丹麥血清進行了比較，其中原有庫存血清為未進行非特異性凝集消除的原血清，用其對臨床菌株進行O抗原血清型鑒定時常無法確定單一血清型，而新制備的血清以及丹麥血清均為去除抗血清的非特異凝集后的單因子血清，試驗結果表明用此二種血清對用原有庫存血清無法定型的菌株進行O抗原血清型鑒定，可以鑒定出單一血清型。

抗血清的特異性是決定試驗方法可靠性的重要因素，這也是眾多研究者試圖解決的問題。吸收是消除抗血清非特異性凝集的經典方法，稀釋的方法也常被應用到細菌抗血清的制備中[11-12]。本研究采用吸收與稀釋相結合的方法去除抗血清的非特異性凝集，從而獲得特異性較高的單因子血清。

本研究確定了大腸桿菌O抗原定型血清的制備工藝，所制備的O抗原定型血清各項指標經檢測均合格，無菌、特異，達到國外同類產品水平，可用于大腸桿菌O抗原血清型的鑒定。

[1] GB/T 4789.6-2003. 食品衛(wèi)生微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗[S].

[2] WS/T 8-1996. 病原性大腸艾希氏菌食物中毒診斷標準及處理原則[S].

[3] 馬長賓，陳文武，陳海軍，等. 規(guī)模化豬場仔豬源大腸桿菌血清型調查及耐藥性檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2016，48(3)：27-32.

[4] 韋麗莉. 廊坊地區(qū)雞大腸桿菌的血清型鑒定及藥敏試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015，1：79-81.

[5] 楊彩霞，張冰，寧鵬飛，等. 遼寧地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸桿菌的血清型及耐藥性調查[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2016，52(6)：92-94.

[6] 伍莉，陳鵬飛. 鴨致病性大腸桿菌的血清型鑒定及敏感藥物的臨床應用[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2015，51(12)：41-43.

[7] 中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部[S].

[8] Caroff M. Structural and functional analyses of bacterial lipopolysaccharides[J]. Microbes and Infection, 2002, 4: 915-926.

[9] Reeves P R. Role of O-antigen variation in the immune response[J]. Trends in Microbiology, 1995, 3: 381-386.

[10]Reeves P R, L Wang. Genomic organization of LPS-specific Loci[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2002, 264(1): 109-350.[11]Mittal K R, Higgins R, Lariviere S. Quantitation of serotype-specific and cross-reacting group-specific antigens by coagglutination and immunodiffusion tests for differentiatingActinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniaestrains belonging to reacting serotypes 3, 6 and 8[J]. J Clin Microbiol, 1988, 26: 985-989.

[12]Mittal K R, Higgins R, Lariviere S. Identification and serotyping ofHaemophiluspleuropneumoniaeby coagglutination[J]. J Clin Microbiol, 1983, 18:1351-1354.

(編輯：李文平)

Preparation of Mono-specific Anti-O-antigen Serum ofE.coli

ZHANG Yuan, LIU Bo, WANG Xiu-li, ZHANG Lei, LI Jian,PENG Guo-rui, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Mono-specific anti-O-antigen serum ofEscherichiacoli(E.coli) was developed and prepared in this research. Firstly, antigens were prepared usingE.coli

trains of CVCC1345 (O2), CVCC1350 (O7) and CVCC1414 (O74) respectively and raw sera were obtained from rabbits immunized with the antigens above separately. Productive technology of raw serum was optimized by comparing different immune procedures and doses of the three antigens. Then ten raw sera were harvested using the optimized productive technology by immunizing rabbits with antigens prepared from 10E.colireference strains CVCC1343(O1)，CVCC1345(O2)，CVCC1350(O7)，CVCC1405(O64)，CVCC1414(O74)，CVCC1439(O100)，CVCC1442(O103)，CVCC1455(O116)，CVCC1466(O128)，CVCC3801(O154). Cross-agglutination was detected by reacting sera with 180 micro-agglutination test antigens respectively and eliminated by absorption with non-specific antigens and dilution. Finally mono-specific anti-O-antigen sera ofE.coliwere obtained. Quality evaluation of sera showed that newly prepared mono-specific anti-O-antigen sera were colorless, pale yellow or yellow clear sterilized liquid with good specificity. Only a few had a little floccule. Agglutination titer was 1∶2. All the results suggested that newly prepared mono-specific anti-O-antigen sera could be applied in serotype identification of clinical isolatedE.colistrains with their good specificity.

Escherichiacoli; somatic antigen; mono-specific serum

張媛，副研究員，從事需氧菌類生物制品檢測工作。

2016-09-18

A

1002-1280 (2016) 11-0009-08

S855.1