木犀草素聯(lián)合慶大霉素對(duì)耐藥化膿隱秘桿菌抑制作用的研究

宋雪嬌，劉耀川，高翔，孫婷婷，田春蓮，趙敬翠，張德顯，劉明春*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866; 2.建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)督所，遼寧建平 122400)

木犀草素聯(lián)合慶大霉素對(duì)耐藥化膿隱秘桿菌抑制作用的研究

宋雪嬌1，劉耀川1，高翔1，孫婷婷1，田春蓮1，趙敬翠2，張德顯1，劉明春1*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866; 2.建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)督所，遼寧建平 122400)

為探究木犀草素聯(lián)合慶大霉素對(duì)耐藥化膿隱秘桿菌的抑制作用，采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定木犀草素和慶大霉素對(duì)34株化膿隱秘桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。選取對(duì)慶大霉素耐藥的化膿隱秘桿菌，通過(guò)棋盤(pán)法測(cè)定兩種藥物聯(lián)合抑菌效果。經(jīng)亞抑菌濃度木犀草素作用耐藥菌株，比較木犀草素作用前后化膿隱秘桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥性變化情況。結(jié)果表明，木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌的MIC值為39～156 μg/mL，與慶大霉素聯(lián)合的作用為不相關(guān)；耐藥菌經(jīng)亞抑菌濃度木犀草素(1/4MIC)作用36 h后，慶大霉素對(duì)耐藥菌的MIC值下降2～32倍，且原菌株耐藥水平越高，MIC下降倍數(shù)越高。提示木犀草素具有良好抗菌活性，且能夠逆轉(zhuǎn)化膿隱秘桿菌耐藥性。

木犀草素；化膿隱秘桿菌；藥物聯(lián)合；抗菌作用；逆轉(zhuǎn)耐藥

近年來(lái)，細(xì)菌的耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，耐藥水平越來(lái)越高，給養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成極大困擾[1]。新型抗菌藥物和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性藥物制劑的研發(fā)已成為學(xué)者研究的熱點(diǎn)。我國(guó)傳統(tǒng)中藥不但具有廣譜抗菌作用，還能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥，可以減輕細(xì)菌的選擇壓力，從而不易產(chǎn)生耐藥性[2]。木犀草素作為天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-5]。早在20世紀(jì)80年代，我國(guó)學(xué)者首次闡明仙鶴草提取物木犀草素-7-葡萄糖苷具有良好抗菌活性[6]，且隨著木犀草素及其衍生物抗菌活性研究逐漸深入，越來(lái)越多相關(guān)報(bào)道表明木犀草素對(duì)多種耐藥菌具有明顯抑制作用，甚至逆轉(zhuǎn)耐藥菌對(duì)抗生素敏感性，如木犀草素不僅具有良好抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)活性，還能夠恢復(fù)耐藥菌對(duì)青霉素的敏感性[7-8]。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌作用的報(bào)道，本試驗(yàn)主要探討木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌的抑菌效果，及逆轉(zhuǎn)化膿隱秘桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥性情況，以期為木犀草素作為抗耐藥菌新藥的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 34株奶牛子宮內(nèi)膜炎化膿隱秘桿菌分離株(HC03-1、HC13-7、HCH03-3、HCH14-1、HCH02-2、BM04-2、QMC01-3、WBX02-1等)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC19411),美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)。1.2 抗菌藥物 木犀草素(批號(hào)14100463),上海純優(yōu)生物科技有限公司；慶大霉素對(duì)照品(590 IU/mg),中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、MH瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；TBD胎牛血清，天津?yàn)笊锟萍贾破酚邢挢?zé)任公司。1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；氣浴恒溫震蕩培養(yǎng)箱(常州國(guó)華電器有限公司)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、微量可調(diào)移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 菌液制備 取實(shí)驗(yàn)室保存的試驗(yàn)菌株甘油菌接種于3 mL NB肉湯(含8%TBD胎牛血清)培養(yǎng)基中，在37℃、120 r/min恒溫振蕩箱中震蕩培養(yǎng)18 h；劃線接種到 MH(A)血瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h。在平板上挑取單菌落，接種到NB肉湯中，37℃、120 rmp/min恒溫振蕩箱中震蕩培養(yǎng)18 h，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為1×105～1×106CFU/mL。

2.2 藥液制備 精確稱量木犀草素、慶大霉素，并按照說(shuō)明使用適當(dāng)溶劑溶解，分別配制成終濃度為1000和1280 μg/mL的儲(chǔ)存藥液，分裝，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?.3 MICs測(cè)定 以化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19411為質(zhì)控菌株，采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定木犀草素、慶大霉素對(duì)34株化膿隱秘桿菌分離株的MIC值，37℃培養(yǎng)24 h 后能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度即為該藥物對(duì)細(xì)菌的MIC值，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，依據(jù)參考文獻(xiàn)判斷結(jié)果[9-10]。2.4 兩藥聯(lián)合對(duì)耐藥菌株的藥敏試驗(yàn) 以耐慶大霉素的化膿隱秘桿菌為受試菌株，采用微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定木犀草素與慶大霉素的聯(lián)合抑菌濃度，計(jì)算聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index, FICI)。判定方法：FICI=(MICa聯(lián)合/MICa單獨(dú))+(MICb聯(lián)合/MICb單獨(dú))，F(xiàn)ICI≤0.5，兩者協(xié)同；0.5 < FICI ≤1，兩者相加；1 < FICI≤4，兩者不相關(guān)；FICI>4，兩者拮抗[11-12]。

2.5 亞抑菌濃度木犀草素對(duì)耐藥菌株耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 根據(jù)木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌MIC的測(cè)定結(jié)果，將木犀草素配制成低于MIC的不同濃度梯度藥液，終濃度為對(duì)應(yīng)菌株的MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC，37℃培養(yǎng)，分別于18、24、30、36、42、48、54、60 h取100 μL培養(yǎng)物接種于NB肉湯，37 ℃120 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，測(cè)定慶大霉素對(duì)該菌的MIC值[13-14]。針對(duì)木犀草素逆轉(zhuǎn)耐藥的菌株，進(jìn)行五次傳代，最后通過(guò)藥敏試驗(yàn)比較慶大霉素對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥菌株傳代前后的MIC值變化情況[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 MICs測(cè)定結(jié)果 木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌ATCC19411的MIC值為78 μg/mL，對(duì)化膿隱秘桿菌分離株的MIC為39～156 μg/mL。根據(jù)CLSI規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定慶大霉素對(duì)34株化膿隱秘桿菌MIC結(jié)果顯示，8株分離菌株對(duì)慶大霉素產(chǎn)生耐藥性，耐藥率達(dá)23.5%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 木犀草素與慶大霉素對(duì)化膿隱秘桿菌的MIC測(cè)定結(jié)果

3.2 兩藥聯(lián)合對(duì)耐藥菌株藥敏分析結(jié)果 木犀草素聯(lián)合慶大霉素作用于化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19411和耐藥菌株，F(xiàn)ICI范圍在1.125～4之間，結(jié)果顯示兩者不相關(guān)，如表2所示。

表2 木犀草素聯(lián)合慶大霉素抗菌活性的測(cè)定結(jié)果

FICI =(MICa聯(lián)合/MICa單獨(dú))+(MICb聯(lián)合/MICb單獨(dú))，F(xiàn)ICI=0.5，兩者協(xié)同(SYN)；0.54，兩者拮抗(ANT)。

3.3 木犀草素對(duì)耐藥菌株的逆轉(zhuǎn)作用結(jié)果 通過(guò)對(duì)比木犀草素不同作用時(shí)間和不同濃度下，耐藥菌株恢復(fù)對(duì)慶大霉素敏感性的情況，得到木犀草素對(duì)耐藥菌株的最佳逆轉(zhuǎn)條件，如表3所示。經(jīng)過(guò)MIC亞抑菌濃度木犀草素作用后，可使化膿隱秘桿菌耐藥菌株變得相對(duì)敏感，其中5株對(duì)慶大霉素耐藥的菌株經(jīng)木犀草素作用后MIC值均不同程度下降，且原耐藥菌耐藥水平越高，慶大霉素對(duì)細(xì)菌MIC值下降越多。

表3 亞抑菌濃度木犀草素作用后慶大霉素對(duì)菌株的MIC變化情況

木犀草素逆轉(zhuǎn)耐藥菌株經(jīng)傳代五次后對(duì)慶大霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，5株逆轉(zhuǎn)耐藥菌株中有2株原高度耐藥菌MIC值恢復(fù)到藥物作用前，3株仍保持相對(duì)敏感性，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)耐藥菌株傳代后耐藥性不穩(wěn)定。木犀草素作用前、作用后及傳代后，慶大霉素對(duì)耐藥菌的MIC值比較結(jié)果如圖1所示。

圖1 木犀草素作用前后慶大霉素對(duì)菌株MIC值比較

4 討論與小結(jié)

4.1 木犀草素抗菌作用 有關(guān)木犀草素抗菌作用方面的報(bào)道越來(lái)越多，如木犀草素對(duì)金黃色葡萄球菌、念珠菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均具有良好抑制效果[16-17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，木犀草素對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性(MIC=90 μg/mL)，且隨著木犀草素濃度增加，其抗菌活性隨之增強(qiáng)，它是通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性進(jìn)而阻止了相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響菌體正常的生理功能，最終抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[10,15]。本研究表明木犀草素對(duì)化膿隱秘桿菌具有較強(qiáng)的體外抗菌活性，其對(duì)34株化膿隱秘桿菌MIC值為39～156 μg/mL，且對(duì)耐抗生素的菌株亦有良好的抗菌作用。

4.2 木犀草素聯(lián)合慶大霉素抗菌作用 臨床上常考慮采用聯(lián)合用藥，治療耐藥菌引起的混合感染、重癥感染，這樣不僅能提高療效、降低毒性，還能延緩甚至避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，木犀草素與慶大霉素聯(lián)合作用于耐藥化膿隱秘桿菌，F(xiàn)ICI范圍在1.125～4之間，說(shuō)明兩種藥物不相關(guān)，聯(lián)合使用不能增強(qiáng)抗耐藥化膿隱秘桿菌效果。但據(jù)張新娟[18]報(bào)道，木犀草素與喹諾酮類和氨基糖苷類藥物聯(lián)用對(duì)MRSA具協(xié)同抑菌作用。木犀草素與頭孢他啶聯(lián)合使用，在治療產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶化膿鏈球菌感染方面具有極大潛力，其可能的機(jī)制有三種：抑制肽聚糖的合成、增加細(xì)胞膜滲透性、降低核酸含量[19]。上述差異可能與藥物種類以及受試菌屬不同有一定的關(guān)系。

4.3 木犀草素逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥作用 據(jù)報(bào)道，經(jīng)亞抑菌濃度木犀草素作用于耐藥金黃色葡萄球菌24 h后，能夠恢復(fù)青霉素對(duì)耐藥菌的敏感性，其機(jī)制是抑制細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性[8]。木犀草素不僅能夠抑制耐阿莫西林大腸桿菌，而且與阿莫西林聯(lián)用能夠逆轉(zhuǎn)大腸桿菌對(duì)阿莫西林的耐藥性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木犀草素作用后，耐藥化膿隱秘桿菌可不同程度恢復(fù)對(duì)慶大霉素的敏感性，且隨著原耐藥菌耐藥水平越高，慶大霉素對(duì)細(xì)菌MIC值下降越多。但逆轉(zhuǎn)菌株經(jīng)傳代后對(duì)慶大霉素的敏感性不太穩(wěn)定。綜上所述，木犀草素的確具有較好的抗菌活性，可以緩解細(xì)菌耐藥性增長(zhǎng)，在生產(chǎn)實(shí)踐中有一定的意義，但有關(guān)木犀草素對(duì)耐藥化膿隱秘桿菌的逆轉(zhuǎn)耐藥作用的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

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(編輯：陳希)

Study on Inhibiting Effects of Luteolin Combined with Gentamicin Against Drug-resistantTrueperellapyogenes

SONG Xue-jiao1, LIU Yao-chuan1,GAO Xiang1, SUN Ting-ting1, TIAN Chun-lian1,ZHAO Jing-cui2, ZHANG De-xian1, LIU Ming-chun1*

(1.CollegeofAnimalHusbandaryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China;2.JianpingSupervisionInstituteofAnimalProductSafety,Jianping,Liaoning122400,China)

To explore the antibacterial effects of luteolin combined with gentamicin，the minimum inhibitory concentrations (MICs) of luteolin and gentamicin against 34 strains ofTrueperellapyogenes(T.pyogenes) were tested by broth microdilution method. The gentamicin resistance isolates were selected to determine the co-antibacterial effects between luteolin and gentamicin by the chessboard method. The drug-resistant levels among these isolates were observed after treating with luteolin at a sub-inhibitory concentration. The results indicated that the MIC of luteolin ranged from 39 to 156 μg/mL, meanwhile there was no co-effects againstT.pyogenesbetween luteolin and gentamicin. The MICs of these resistant isolates become 1/2 to 1/32 after treating 36 h with a sub-inhibitory concentration (1/4MIC) of luteolin, the MICs decreased significantly as the antibiotic resistant levels become higher. The results show that luteolin has a good antibacterial activity and it can reverse the drug resistance ofT.pyogenes.

luteolin;T.pyogenes; combination between antimicrobial agents; antibacterial effect; reversing drug resistance

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201954、31572564)

2016-07-25

A

1002-1280 (2016) 11-0054-05

S852.61

OL].

10.1155/2013/659183,2013.