共價修飾法制備新型多巴胺傳感器

竇志宇，張博文，吳燕英

（長春理工大學化學與環境工程學院，長春 130022）

共價修飾法制備新型多巴胺傳感器

竇志宇，張博文，吳燕英

（長春理工大學化學與環境工程學院，長春 130022）

在實驗中將4arm-PEG-NH2和羥基苯基鐵卟啉共價修飾到玻碳電極上，成功地制備了一種新型DA傳感器。由于Fe（OH）4P和4arm-PEG-NH2的協同效應，使得該傳感器對多巴胺的電催化活性得到明顯的提高，氧化過電位也得到了降低。在示差脈沖伏安法測定中（多巴胺的檢測范圍為0.2～125μmol L-1），計算獲得DA的檢出限為1.02×10-8M。

四臂-聚乙二醇-氨基復合物；5，10，15，20-四羥基苯基鐵卟啉；兩步共價修飾；多巴胺

做為單胺類神經遞質中的一種，多巴胺（DA）在調節荷爾蒙的分泌、中樞神經系統及心血管系統的活動等方面發揮了巨大的作用，它的濃度過高或過低都將直接或間接地引起一些疾病的發生［1-5］。所以多巴胺自被發現伊始，便在臨床應用領域獲得了廣泛的關注，也因此有大量檢測多巴胺的方法在過去的幾十年中被相繼開發出來，比如熒光法［6］、化學發光法、離子色譜法［7］、毛細管電泳法等。相對比其他檢查手段而言，電化學方法以其較快的檢測速度，相對簡單的制備過程，良好的重復性，低廉的制備成本等優點，成為該領域的研究熱點［8-10］。但同時也不能忽略一個事實，那就是多巴胺的電化學檢測非常容易受到其他生物活性分子的干擾，如抗壞血酸，尿酸，腎上腺素等等。從大量的研究結果中發現，人們在嘗試以電極修飾的方式來解決這些問題，可以應用的修飾材料包括金屬納米粒子［11，12］，導電聚合物涂覆的電極［13，14］，納米材料修飾的碳基質［15］，金屬卟啉等等［16］。

在對亞硝酸鹽、揮發性有機物、一氧化碳和DA等生物和環境中重要分子的檢測方面，金屬卟啉作為電極修飾材料表現出了優異的電催化性能［17-19］。但同時也看到，單獨以金屬卟啉作為電極修飾材料制備的多巴胺傳感器，仍會出現過電位較高的現象。而很多的研究結果證實，聚乙二醇單甲醚修飾的電極對提高DA的氧化還原活性、降低其氧化過電位起到了很好的促進性的作用。四臂-聚乙二醇-氨基復合物（4arm-PEG-NH2）作為類似的非離子型表面活性劑，同樣可顯著降低在電化學反應過程中電活性分子的過電位。

鑒于這兩類物質對DA均具有良好的電化學催化活性，在實驗中嘗試將4arm-PEG-NH2和羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）共價修飾錨定到電極的表面獲得一種多巴胺傳感器，并對修飾電極的電催化性能進行了系統的研究。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

4arm-PEG-NH2和多巴胺（98%）購于Aladdin試劑公司；抗壞血酸、磷酸鹽、無水乙醇、氯化鉀、氫氧化鈉均為分析純；DMF（99%）購于薩思化學技術有限公司；另外，5，10，15，20-四羥基苯基鐵卟啉利用文獻方法制備［20］。

用CHI660D型電化學工作站（上海辰華）測試電化學，采用三電極體系，以修飾電極（GCE）或裸玻碳電極做為工作電極，飽和甘汞電極做為參比電極，對電極為鉑絲；采用PBS緩沖溶液（pH=7，濃度為0.2M）做為測試溶液；使用KQ-100DE型數控超聲波清洗器對樣品超聲清洗。

1.2 實驗過程

修飾之前，需要依次用1.0μm，0.3μm和0.05μm的α-氧化鋁粉末對裸GCE電極進行打磨拋光，然后再分別利用三次蒸餾水、乙醇和三次蒸餾水對電極超聲處理各2分鐘，最后氮氣吹干。為了活化該修飾電極，還需將其放到pH=7.0的PBS溶液中進行循環伏安掃描（電位范圍-0.2V～+0.2V，掃速為10mV s-1），待循環伏安曲線穩定即可停止活化。把該活化電極放到20mL溶解了40mg Fe（OH）4P的DMF溶液中，以0.1M的四丁基高氯酸銨（TBAP）做為支持電解質進行循環伏安掃描（掃速20mV s-1，電位區間-1.2V～+1.6V）。繼續將該活化電極放到溶有20mL 50mg 4arm-PEG-NH2和48mg LiClO4的緩沖溶液（pH=7）中，循環伏安掃描15圈（電位區間為0～+1.0V，掃速為20mV s-1）。將修飾電極用三次蒸餾水沖洗，氮氣吹干，在紅外燈下烘10分鐘。

2 結果與討論

2.1 Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2在GCE上的電化學修飾

實驗中是先后兩步把羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）依次錨定到玻碳電極上的。通過循環伏安掃描（掃描電位區間在-0.2～+0.2V）的方式活化玻碳電極，活化完成后在玻碳電極的表面將富集大量的碳正離子。然后通過親核取代反應，將羥基苯基鐵卟啉結構上的羥基與活化電極表面的碳正離子共價結合；最后仍然通過親核取代反應，使四臂-聚乙二醇-氨基聚合物結構中的氨基與電極表面剩余的碳正離子共價鍵合，修飾過程如圖1所示。

圖1 循環伏安圖

2.2 修飾電極催化氧化DA

圖2為分別通過裸電極（電極a）、活化電極（電極b）、羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）修飾電極（電極c）、四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）修飾電極（電極d）以及Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極（電極e）檢測20μM DA緩沖溶液得到的系列循環伏安曲線。不難發現，DA對裸電極（a）幾乎沒有任何響應；從電極b的檢測曲線中可以看出，峰電位差變?。ép=177mV），電流響應仍然不強；雖然可以從單獨修飾Fe（OH）4P的電極（c）的檢測曲線中觀察到一對明顯的氧化還原峰，但卻出現非常大的背景電流；四臂-聚乙二醇修飾的電極（d），峰形變尖，電流響應明顯增大；而電極e較之于裸電極，氧化峰與還原峰電位差明顯變小（ΔEp= 19mV），峰電流明顯增強。有力地證明了羥基苯基鐵卟啉和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物復合物薄膜加快了電子轉移速率，提升了電化學氧化DA反應的可逆性。

圖2 五種不同電極在DA緩沖溶液的循環伏安圖（20μM，pH=7，掃速50mV s-1）

2.3 掃速的影響

為了研究DA在修飾電極表面的電化學行為，在實驗中固定了多巴胺濃度為20μM并改變掃描速度（從10mV s-1到500mV s-1），得到一系列循環伏安曲線，如圖3-5所示）。從圖可以看出，氧化和還原峰電流隨著掃速的增大也相應變大，同時氧化峰電流發生正移，還原峰電流發生負移。另外，當掃速較低時（10～180mV s-1），峰電流與掃速呈現出很好的線性關系；而在較高掃速（200～500mV s-1）時，峰電流和掃速的平方根呈現很好的線性關系。這些實驗結果說明：在低掃速時DA的電化學反應呈現出了受表面吸附控制的特點，而高掃速時修飾電極表面的DA反應是受擴散控制的。

圖3 共修飾電極在不同掃速下的循環伏安圖

圖4 Ipc和Ipa與掃速關系曲線圖

圖5 Ipc和Ipa與掃速平方根關系曲線圖

2.4 pH值的影響

為了進一步探討Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極對多巴胺的電催化行為，還改變了酸堿條件（pH=3.0-9.0）對20μM的DA緩沖溶液進行循環伏安掃描，得到一系列循環伏安曲線（如圖4）。從圖4中可以看出，多巴胺的氧化峰電位和還原峰電位隨pH值的增大而逐漸負移，所以推測在共修飾電極上有質子參與到多巴胺的氧化還原反應過程中。

圖6 不同pH值（3-9）的DA緩沖溶液在共修飾電極上的循環伏安曲線

同時也發現在pH值從3.0到9.0區間，Epa值與pH值表現出較好的線性關系（圖7B），斜率值為-59.51mV pH-1（接近理論值-59mV pH-1），可以推斷，Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極對多巴胺的電催化氧化是等電子等質子過程。同時，通過修飾電極所測得的多巴胺氧化峰電流值與pH值的關系曲線（圖7A）不難發現，在pH=5.0的緩沖溶液中DA的氧化峰電流最大。以此為依據選擇了效果最好的pH=5.0的溶液作為本實驗的緩沖溶液。

2.5 干擾研究

正如前言所述，對多巴胺的檢測必須要排除體液中共存的AA等其它生命基質的影響，所以在檢測多巴胺時研究了共修飾電極對其他物質的抗干擾能力。選取了含AA（濃度為DA的25倍）和DA的混合溶液，對其進行DPV檢測。從圖8可以看出，DA和AA氧化過電位未出現重疊，且兩峰差值為212mV。說明即使在含有高濃度AA的情況下，Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極仍對多巴胺表現出了很高的靈敏性、良好的選擇性。

圖7 DA隨pH變化關系圖

圖8 修飾電極在含有50μM DA和1000μM AA的pH 5.0的緩沖溶液中的循環伏安圖。

2.6 檢測DA

圖9是不同濃度的多巴胺緩沖溶液（pH=5.0）在Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極上的示差脈沖伏安圖（DVP），發現在0.2～125μM的濃度范圍內，峰電流隨多巴胺濃度的增加而線性增加，得到的線性方程為：ipa（μA）=0.6041+0.2357C（μM），相關系數r為0.9990。該修飾電極通過公式Cm=3sbl/m計算得到的最低檢測限為1.02×10-8M，傳感器靈敏度為235.7μA mM-1?？梢?，由于Fe（OH）4P與4arm-PEG-NH2之間的協同作用，大大改善了修飾電極的檢測限和靈敏度，拓展了其應用性。

圖9 不同濃度DA的緩沖溶液在Fe（OH）4P/ 4arm-PEG-NH2修飾電極上的示差脈沖伏安圖

從（a）到（q）是DA濃度分別為0.2，0.6，1.0，2.0，5.0，10，15，20，25，35，45，55，65，75，100，125μM。插圖為DA濃度與氧化峰電流之間的關系。

2.7 穩定性研究

為了了解共修飾電極的穩定性，將其在室溫下儲存3個月然后通過循環伏安法對20μM的DA緩沖溶液（pH=5.0）進行檢測。從檢測結果來看，DA在放置了3個月的共修飾電極中的氧化峰電流僅降低5.17%，且氧化峰電位沒有發生明顯變化。充分說明，Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極具有較長的使用壽命和非常好的穩定性。

圖10 DA在修飾電極上的循環伏安圖

2.8 真實樣品分析

利用示差脈沖伏安法對人體血液進行的檢測目的在于評估共修飾電極的實際應用性（見表1）。在檢測之前，將人血清樣品用pH值為5.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋20倍。從表中可以看出，在鹽酸多巴胺注射液中DA的回收率分別100.6%，101.7%和99.47%，相對標準偏差較低，結果比較令人滿意。這也預示著通過共修飾的方法制備的多巴胺傳感器有望應用于實際樣本中DA的測定。

表1 在人體血清樣品中測定DA的結果

3 結論

通過兩步共價修飾的方法，成功地將羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）錨定到玻碳電極表面。在隨后的研究中發現，Fe（OH）4P和4arm-PEG-NH2兩種物質具有很好的協同作用，使得該電極表現出了優異的電化學催化活性。主要體現在用共價修飾方法所得到的多巴胺傳感器具備優異的選擇性和較高的靈敏度，很好的穩定性，較低的檢出限，較長的使用壽命等等，而這些都使得它具備了很好的應用前景。

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Construction of Novel Dopamine Sensors Based on Covalent Modification Procedure

DOU Zhiyu，ZHANG Bowen，WU Yanying
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022）

We presented a novel dopamine（DA）sensor via a two-step covalent modification approach via anchoring 5，10，15，20-tetrakis（4-hydroxyphenyl）porphyrin（Fe（OH）4P）and 4-arm-（polyethylene glycol）-aminor（4 arm-PEGNH2）onto a glassy carbon electrode（GCE）.The fabricated sensor showed a pronounced electrocatalytic activity improvement toward the oxidation of DA and led to a significant decrease in the anodic overpotentials compared with bare GCE，which should be ascribed to the synergistic effect of Fe（OH）4P and 4arm-PEG-NH2-GCE.Using differential pulse voltammetry（DPV），the sensor gave a linear response to DA over the concentration range of 0.2～125μM，with a detection limit of 1.02×10-8M.

4-arm-（polyethylene glycol）-amino；5，10，15，20-tetrakis（4-hydroxyphenyl）porphyrin；two-step covalent modification；dopamine

O657

A

1672-9870（2016）06-0062-05

2016-08-02

竇志宇（1979-），女，博士，講師，E-mail：douzhiyu79@sina.cn