山東省地方品系種雞禽白血病凈化技術的經驗與探討*

秦卓明，徐懷英，馬秀麗，黃兵，李福偉，雷秋霞，李玉峰，曹頂國，逯巖，崔治中

（1.山東農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250023；2.山東農業大學，山東 泰安 271018）

山東省地方品系種雞禽白血病凈化技術的經驗與探討*

秦卓明1，徐懷英1，馬秀麗1，黃兵1，李福偉1，雷秋霞1，李玉峰1，曹頂國1，逯巖1，崔治中2

（1.山東農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250023；2.山東農業大學，山東 泰安 271018）

按照崔治中教授推薦的方案，對山東省農業科學院家禽研究所保存的優質地方品種雞，分別進行了多年的禽白血病持續凈化。禽白血病病毒p27病原攜帶率由凈化前的平均50%以上，降低到目前的不足5%，部分品種的1日齡雛雞胎糞檢測已經連續三代ALV p27病原陽性率控制在0.3%以內，開產前的母雞蛋清陽性率已連續2代低于1%，凈化效果明顯。該凈化方案為我國地方品種雞禽白血病的凈化提供了一條技術可行的操作路徑。

禽白血病病毒；地方品種雞；凈化

禽白血?。ˋvian leucosis virus，ALV）是由反轉錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，具有血清型多 （包括A、B、C、D和J亞型）、亞臨床感染、垂直傳播、感染率高等特點，既可誘發產生腫瘤，導致雞群死亡，又可導致雞群生長發育遲緩、免疫抑制等，并嚴重影響生產性能[1-2]。

經過世界禽白血病凈化專家近20～30年的努力，目前國際上保留下來的不同品系的白羽肉用型種雞或蛋用型種雞群均已基本凈化了不同亞群的家禽外源性白血病。但在我國，由于歷史原因，我國自繁自養的地方品種雞群大多都不同程度感染了經典的A或B亞群ALV，甚至感染了隨白羽肉雞由國外傳入的J亞群ALV[3-4]。流行病學調查顯示：部分純地方品種雞群對ALV-J的感染率已相當高，且已開始表現典型的髓細胞瘤和其他禽白血病的病理變化[3-5]。因此，適時開展地方品種雞群ALV凈化對于保障我國地方品種種子資源，防止禽白血病散播和流行意義重大。

山東省農業科學院家禽研究所為山東省地方雞種子資源基因保存中心，擁有10多個優秀的家禽地方品種資源。為提高種子資源健康和保障后代雛雞質量，提高地方品種的生長和繁育性能，我們對保存的部分地方品種雞進行了禽白血病初步凈化，并對其中的4個品種進行了重點凈化。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 禽白血病p27抗原ELISA檢測試劑盒、AB/J亞型抗體ELISA診斷試劑盒，均購自美國IDEXX公司；農業部哈爾濱獸醫研究所研制的禽白血病P27抗原ELISA檢測試劑盒 （高玉龍研究員惠贈，在此表示感謝）。

1.1.2 細胞系 DF-1細胞系，山東農業大學趙鵬博士惠贈，由山東省農業科學院家禽研究所保存。

1.2 樣品采集 對不同品種母雞的泄殖腔棉拭子、蛋清及公雞的精液以及1日齡雛雞胎糞分別進行了p27抗原檢測。

1.3 地方品種核心群外源性ALV凈化的程序從2008年以來，我們就陸續開始按照崔治中教授的建議進行白血病凈化[6]。程序如下：

1.3.1 開產初期（23～25周齡）檢測和淘汰 初產期往往是雞群禽白血病病毒排毒高峰期，開產前公、母雞全部帶翅號，每個剛開產母雞連續3枚蛋的蛋清用ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒做p27抗原檢測，淘汰陽性雞。公雞可采集精液檢測p27抗原，淘汰陽性雞。鑒于部分雞品種的精液p27假陽性率太高，可對其血漿做病毒分離，以病毒分離的結果為準。對每只后備種雞分別采集血漿接種DF-1細胞分離病毒，培養9d后用ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒逐孔檢測細胞，淘汰陽性種雞。如果后備種雞是小群飼養，同一小群中如有一只為陽性，淘汰該小群所有雞。

1.3.2 留種前（40～45周齡）檢測和淘汰 取樣原則和檢測方法同上，淘汰陽性種雞同上。在感染嚴重的核心種雞群，經過上一輪檢測淘汰后，部分地方品系的種雞在數量上可能不能滿足遺傳多樣性的育種原則，但也要從嚴淘汰。作為補充，對于一些生物學性狀確實優秀的個體，仍然可以保留，但必須與所有陰性雞隔離飼養。從這些檢測陽性的種雞采集的種蛋再單獨孵化，相應雛雞按同樣的凈化程序單獨隔離飼養，從由此長成的下一代育成雞中仍可篩選出陰性雞，然后再并入前一世代篩選出的同一品系陰性雞群，以彌補地方品種雞數量不足難題。本文中的蘆花雞即采用此方案。

1.3.3 種蛋的選留和孵化 經上面兩輪篩選后，選留的每只母雞，應只跟選留公雞群中的1只公雞的精液授精，且按規定時間留足種蛋，每只母雞所產的蛋均標上同一母雞號，置入孵化箱時集中放置。在孵化18d后出殼前，將每只母雞所產種蛋置于同一標號的專用滅菌紙袋中，再轉到出雛箱中出雛袋（出雛袋厚度0.15mm，規格22×18cm，在雛雞高度以上的位置，在紙袋的四周打出10～12個直徑約1cm透氣孔），所選雛雞作為凈化后的第一世代。本文未嚴格按照此方法命名，兼顧了常規育種的命名。

1.3.4 雛雞1日齡胎糞檢測 出雛后，用棉拭子逐只采集1日齡雛雞胎糞 （每只操作完必須更換手套或徹底洗手消毒），置于小試管中。利用ALV抗原ELISA檢測試劑盒檢測胎糞p27抗原。要注意，同一只母雞所產雛雞中，有一只陽性即要淘汰同紙袋中的所有雛雞，同時淘汰相應種雞。

對選留的雛雞，以母雞為單位，同一母雞的雛雞放于一個籠中隔離飼養。每個籠間用紙板隔離，避免不同籠內雛雞的直接接觸及直接氣流的對流造成ALV橫向傳播。

1.3.5 育雛6周齡后病毒血癥檢測 育雛期結束，采雞血漿，接種DF-1細胞分離病毒，培養9d后用ALV抗原ELISA檢測試劑盒逐孔檢測[7]，淘汰陽性后備雞。對選留的后備種雞，仍應維持小群隔離飼養，盡量使同一母雞的后代置于一個小群中。

1.3.6 凈化后第一世代留種雞開產初期 （約23～25周齡）檢測和淘汰 操作同1.3.1。

1.3.7 凈化第一世代留種前 （約40～45周齡左右）檢測和淘汰 操作同1.3.2。

1.3.8 第二世代雞的檢測和淘汰 對經上述1.3.1到1.3.7步檢測淘汰后種雞的出殼雛雞，作為凈化后第二世代雞。繼續按1.3.4到1.3.7的程序，實施第二世代的檢測和凈化。第三世代以后，視凈化的進展程度可按此程序繼續循環進行，但應視凈化的進展程度逐級調整。當全群不再檢測出陽性或陽性率很低時，可酌情調整降低p27抗原ELISA反應中判定陽性的s/p閾值，即從嚴淘汰。

1.3.9 凈化程序啟動階段的選擇和維持 以上程序代表一個世代的全部過程，這是一個循環過程。實施上述完整的對核心群雞逐一檢測和淘汰的程序，工作量很大、成本很高。根據國外成功的經驗，當一個核心群連續3個世代都檢測不出ALV感染雞后，可轉入維持期。在進入維持期后，就不需再對每只后備種雞按上述做所有檢測步驟，可改為對一定比例雞的定期抽檢。

1.3.10 借鑒SPF雞生產管理經驗 對于凈化后的雞群，因其凈化成本較高，因此，在管理時，應充分借鑒無特定病原雞（SPF）管理規定隔離封閉飼養。

2 山東省地方品種雞禽白血病病毒凈化結果

2.1 山東省不同地方品種雞禽白血病病毒凈化結果

2.1.1 山東地方品種麻雞3號（B3）凈化的結果 地方品種麻雞3號（B3）為國家審定品系，目前已經連續凈化7代，也是目前ALV凈化最好的品種之一，詳細結果見表1。由表1可見：母雞連續在4～7世代留種或開產前蛋清p27陽性率在1%以下，初步達到國家有關種雞場ALV凈化的標準；公雞精液的P27檢測陽性率呈現顯著降低趨勢，6世代時下降到 1.92%（仍存在一定的非特異性），由于是精液或泄殖腔棉試子檢測，尚不能排除其中的非特異性干擾，已多次對其陽性公雞進行血漿病原分離，均未分到ALV；1日齡雛雞2～4世代1日齡胎糞p27抗原陽性率為1.12%～4.32%，5～7世代胎糞陽性率均小于0.5%（圖1）。

表1 地方品種B3禽白血病凈化不同世代ALV p27抗原感染狀況

圖1 地方品種B3不同凈化世代1日齡胎糞ALV p27抗原陽性率（%）

2.1.2 山東地方品種麻雞1號（B1）凈化結果 地方品種麻雞1號（B1）也是國家審定品系，目前凈化已經進行5年，也是目前ALV凈化最好的地方品種之一，詳細結果見表2。由表2可知，母雞已經連續在3～6世代留種或開產前蛋清p27陽性率在1%以下，初步達到國家有關種雞場ALV凈化的標準；公雞精液的P27檢測陽性率也呈現顯著降低趨勢，6世代時下降到5.15%，多次對陽性雞進行病原分離，均未分到病毒（存在與上同樣的問題）；雛雞胎糞3世代1日齡胎糞p27抗原陽性率較高，為6.17%，4～6世代胎糞已降低到0.5%以下，凈化效果明顯（圖2）。

表2 地方品種麻雞1號（B1）禽白血病凈化不同世代ALV p27抗原感染狀況

圖2 地方品種B1不同凈化世代1日齡胎糞ALV p27抗原陽性率（%）

2.1.3 山東地方品種麻雞2號（B2）凈化結果 山東地方品種麻雞2號（B2）也是國家審定品種，目前已凈化4個世代（詳見表3）。由表3可知，母雞開產前母雞蛋清p27陽性率由2世代的1.86%降低至4世代的0.49%；公雞p27陽性率由37.88%降至目前精液的2.68%；雛雞4世代時1日齡胎糞陽性率降至0%，凈化效果明顯。

表3 山東地方品種麻雞2號（B2）禽白血病不同凈化世代p27抗原感染狀況

2.1.4 山東蘆花雞凈化結果 蘆花雞是地方品種雞中ALV污染較為嚴重的品種，凈化前公雞肛棉拭子p27抗原陽性率為57.95%，母雞蛋清陽性率為37.63%。經3個完整世代的凈化，取得了較好的凈化效果，結果見表4。公雞第三代精液p27抗原陽性率已下降至9.16%；母雞蛋清中抗原陽性率下降到2.29%；雛雞第4世代1日齡胎糞陽性率降至0.58%（第1世代為27.35%），凈化效果顯著（圖3）。

表4 山東地方品種蘆花雞禽白血病凈化不同世代ALV p27抗原感染狀況

圖3 地方品種蘆花雞不同凈化世代1日齡胎糞ALV p27抗原陽性率（%）

2.2 山東省地方品種雞禽白血病病毒抗體普查結果 對凈化后ALV p27抗原檢測陰性的雞 （不同世代開產雞）采集血清，進行了兩次ALV不同亞群抗體的檢測，結果見表5。

表5 山東省地方品種種雞禽白血病血清學抗體陽性率（%）

由表5可見，雞群ALV抗體陽性率的高低與病毒攜帶率不相關。除少數品種ALV-J有個別陽性外，大部分地方品種為陰性。值得警惕的是，幾乎所有的地方品種雞都不同程度地感染了ALV A/B亞群病毒，且抗體陽性的比率在逐年增高，這一點應引起高度關注并分析其內在原因，以便采取相應的對策。

2.3 山東省地方品種雞總體禽白血病病毒凈化結果 在對上述4個品系重點凈化的同時，我們對所內所保存的其他品系，也進行了同步凈化，取得了初步的效果，匯總上面所凈化的結果，一并總結，凈化前后的比較結果見表6。

表6 山東省地方品種禽白血病凈化前后ALV p27抗原陽性率（%）

鑒于部分地方品種的陽性率較高，為避免對其他已凈化品種的傳播，項目組忍痛割愛，進行淘汰。

3 討論

3.1 對地方品種ALV凈化程序和細節的建議 禽ALV凈化主要是對地方品種種雞群進行徹底地凈化。國際通用的慣例是采取至少5次以上的p27抗原檢測進行篩選。對核心群雞全部采用血漿接種DF-1細胞，培養9d后檢測p27抗原，凡陽性者一律淘汰，且分別在68日齡和168日齡做二次采血檢測，另外，對保留的核心雞群的下一代進行1日齡胎糞檢測，淘汰同一窩所有陽性雞，如此反復。此法效果已得到有效證實，但技術要求較高、人力成本、試劑成本以及實驗室條件都比較高，國內雞場很難推廣應用。

社會存在決定著社會關系，但存在多元化的價值觀念并不意味著其具有合理性，“超女熱”“相親熱”“考證熱”“出國熱”等現象需要引起重視。經濟成分的多元化，必然會導致價值觀念的多元化，所以不能簡單地再以重集體輕個人為標準來評價青年的道德水平，而是以青年的價值觀念是否與社會倡導的價值觀念一致以及青年所持有的價值觀念是否有利于社會發展為衡量標準。

崔治中教授自2005年就致力于國內雞群ALV的凈化，在總結大量實踐經驗的基礎上，結合國內外ALV凈化的經驗，提出了我國雞群ALV凈化不同階段所應采取的措施，取得了切實可行的實踐效果。我所自2008年就在崔老師的指導下進行地方品種雞的凈化，積累了一系列成熟的經驗，獲得了一定的成功。在地方品種種禽群凈化前，母雞ALV抗原陽性率最高達60.33%，公雞陽性率高達71.23%。部分品種如瑯琊雞因為ALV感染率過高，而挑不出陰性雞群，不得不淘汰。剩余的雞群均取得了可喜的結果。經過4年的持續凈化，10個地方品種種雞群的陽性率大大降低，其中4個品種的1日齡胎糞p27抗原陽性率降至0.5%以下，母雞蛋清陽性率低于1%，已初步達到國家對種禽場禽白血病的凈化要求。實踐證明：崔老師建議的方案是可行的，且與國外相比，無論是財力還是人力，都適合中國國情。

除此之外，在ALV凈化時，還要關注以下幾個環節：①在世代凈化前，對留種前對母雞和公雞進行檢疫，每只留種公雞精液對應固定的母雞；②同一孵化室只用于一個地方品種來源種蛋的孵化，以預防在孵化室內早期的橫向傳播；③在孵化后期及1日齡雛雞采用小型紙袋進行相對隔離，盡快進行胎糞檢測淘汰陽性雞，最大限度地縮短檢測的時間，提高效率。雛雞籠用擋板隔離，避免橫向傳播。

在凈化的過程中，也出現了ALV感染p27抗原陽性率的反彈，大都發生在開始凈化后的第3～4代，幾乎成為定律。對其中的原因，我們仍在探索之中。

3.2 引進種雞前必須做最嚴格的ALV檢疫 通過對我所地方品種雞ALV凈化前的臨床檢測，結合大量的臨床樣品ALV普查，證實目前我國的地方品種雞大都污染有ALV，且主要是A/B亞群。事實上，早在1982年前，山東省農業科學院家禽研究所試圖從我國地方品種中建立起凈化的無特定病原雞群，經過大約3年的努力，終因ALV感染率過高，且我國雞群內源性白血病E亞群幾乎100%感染，導致凈化無果而終。最后，還是采取了從美國、德國和英國等引種的路子，縮短了我國SPF雞培育成功的時間。當然，引種是獲得家禽新品種的一條捷徑。即便是國際上最優秀的大型育種公司，有時也要從其它來源引進特定的種雞。但當需要從其他來源引進種雞時，在引進雞場前必須對其ALV做嚴格的檢疫和檢測，而且這種檢疫絕不能僅是一次性的[8]。如前所述，雞在感染ALV后的病毒血癥或排毒是間隙性的，而且沒有那一種方法能一次把雞群中的感染和帶毒雞都能檢測出來。所以，至少要檢測到性成熟開始產蛋時。

實際上，1988年在英國發現ALV-J亞群以后的幾年內，該病之所以能在短短幾年內蔓延至全球各國幾乎所有大型白羽肉雞的育種公司的原種核心雞群中，很顯然，這些都與上述公司相互引種直接相關。一旦ALV-J亞群在一個雞群中流行，便很快傳播至其他公司的白羽肉雞群。因為ALV-J主要通過種蛋垂直傳播，而且潛伏期可長達6個月，普通1～2個月的隔離檢查于事無補。1995年前后，為了培育我國自己的快大型黃羽肉雞，縮短育種時間，部分公司在不了解禽ALV-J的危害性和傳播途徑的情況下，引進了國外白羽肉雞作為種雞資源，使之與不同的地方品種雞雜交，從而在保留羽毛的黃色或雜色的同時，還能從白羽肉雞的遺傳性中獲得長得大、生長快、料肉比低的優良特性。然而，正是這一過程，在不經意間把ALV-J帶進了我們自己的核心雞群，并在繁育擴大雞群的過程中，使該病蔓延開來[9-10]，而且帶來的經濟損失越來越大，有時還在養殖企業間造成很大的經濟糾紛。正因為如此，引進外來種雞群時，必須做好對雞群ALV的長期、系統的跟蹤和監測。

3.3 需要特別關注的疫苗問題 對選留雞選用的所有活疫苗，必須經嚴格檢測，確保絕對沒有外源性ALV污染，這一點十分關鍵。除此之外，對滅活苗目前尚存爭議。大多數滅活苗由于是“死”苗，很多人認為是比較安全。但是，我們知道，盡管滅活苗是經過“滅活”的抗原，但滅活不可能完全100%殺滅病毒，從生物學的角度上講，只能是無限接近，少數的“漏網之魚”是可能的。人們關注的僅是“本病毒”是否滅活完全，而忽視了雞的垂直傳播性病原，其中就包括禽白血病病毒、網狀內皮組織增生癥病毒等。在實際的生產中，我們往往對每批弱毒活疫苗批批檢測，而不注重滅活苗的質量檢測。目前需要免疫的滅活苗包括：新城疫病毒、高致病性禽流感的不同亞型病毒（RE-4/RE-5/RE-6/RE-7/RE-8）、低致病性禽流感病毒、減蛋綜合征病毒、傳染性支氣管炎的不同亞型病毒、病毒性關節炎病毒、禽腦脊髓炎病毒等的單苗、聯苗不下十余種，其接種次數在20次左右。頻繁的接種很難保證萬無一失。事實上，在對雞群的禽ALV抗體檢測過程中，我們發現，雞群的日齡愈長，其ALV的A/B亞群抗體陽性率愈高（見表6），而病毒分離又為陰性。鑒于ALV病毒與血清抗體復雜的關系：病毒陽性，抗體可能陰性；病毒陰性，抗體可能陽性；病毒與抗體均為陽性等，上述可能性均存在。這無疑對雞群的ALV凈化增加了難度。也是我們必須的思考所在。因此，進行ALV種源凈化的雞群，其接種的滅活苗制備原料雞胚最好也要SPF化。

其次，由于ALV感染對年齡和感染途徑有很強的依賴性，年齡越小越易感，注射感染比其他途徑易感，所以應高度關注雛雞階段使用的疫苗。一要特別關注的是液氮保存的細胞結合性馬立克氏病疫苗。該疫苗是在出殼后在孵化廳立即注射，而且如果發生污染，也容易污染較大的有效感染量（包括細胞內和細胞外）；其次是通過皮膚劃刺接種的禽痘疫苗。當然，其他弱毒疫苗也要關注。但前面提到的二種疫苗，外源性ALV污染帶來的危害最大。

需要強調的是：對于雞群白血病凈化來講，其所應用的所有疫苗絕不能有ALV的污染。否則，一旦使用了被外源性和內源性ALV污染的疫苗，將使種雞群重新感染ALV，凈化取得的所有成果將化為泡影，務必慎之又慎。

3.4 禽白血病凈化需要長期、持續的堅持和努力 禽白血病的凈化是一個系統工程，需要政府、公司和科研部門等多部門聯動。政府應在政策方面（項目和資金等）予以持續支持，企業應成為ALV凈化的主體，科研部門要做好保駕護航。行百里者半九十，禽白血病凈化任重而道遠。

[1]Y.M.Saif主編，蘇敬良，高福，索勛，主譯.禽病學[M].第12版.北京:中國農業出版社，2012.

[2]崔治中.我國雞群中禽白血病流行現狀和對策[J].中國家禽，2009(13):1-3.

[3]崔治中.我國不同品種雞群中禽白血病的流行情況及誘發腫瘤的多樣性[J].中國家禽，2010(19):40-42.

[4]秦卓明，仉偉，劉霞,等.疑有禽白血病病毒混合感染的肉種雞大肝大脾病[J].家禽科學，2014(11):6-10.

[5]尹青，孫淑紅，柴家前，等.百日雞J-亞群禽白血病組織病理學與超微病理學研究[J].中國獸醫學報，2012(02):290-295.

[6]崔治中.雞白血病及其綜合防控措施[J].獸醫導刊，2010(11):26-29.

[7]秦卓明，徐懷英，馬秀麗，等.從蘆花雞分離的J亞群ALV病毒及其gp85基因演化 [J].浙江農業學報，2014(05):1180-1185.

[8]崔治中.種雞場禽白血病防控和凈化技術方案[J].中國家禽，2015(23):1-7.

[9]劉紹瓊，王波，張振杰，等.817肉雜雞肉瘤組織分離出 A、J亞型禽白血病病毒 [J].畜牧獸醫學報，2011(03):396-401.

[10]張勝斌，吳天威，韋平，等.地方優良雞種禽白血病病毒感染調查及凈化，[J].中國家禽，2010(12):11-16.

S858.31

B

1673-1085（2016）12-0003-09

2016-11-12

國家公益性 （農業） 行業科研專項（201203055）。