絲裂霉素C作為瓊脂擴散法細胞毒性試驗陽性對照材料的探討

賈 璇，王 蕊，史建峰，賀學英

1 北京市醫療器械檢驗所，北京市，101111

2 醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京市，101111

絲裂霉素C作為瓊脂擴散法細胞毒性試驗陽性對照材料的探討

【作 者】賈 璇1,2，王 蕊1,2，史建峰1,2，賀學英1,2

1 北京市醫療器械檢驗所，北京市，101111

2 醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京市，101111

目的 為細胞毒性評價方法——瓊脂擴散法探尋具有適度細胞毒性、揮發性小且易于獲取的陽性對照材料。方法 按照ISO 10993.5-2009與YY/T 0127.9-2001規定的瓊脂擴散法，使用L-929細胞接種于培養皿內，培養至近匯合單層細胞，倒入瓊脂并用中性紅溶液染色，絲裂霉素C作為試驗材料進行試驗，樣品濃度分別為2 mg/mL、1 mg/mL與0.5 mg/mL。結果2 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級為3級；1 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級為3級；0.5 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級為2級。結論 2 mg/mL濃度的絲裂霉素C可作為瓊脂擴散法評價細胞毒性時的陽性對照材料。

瓊脂擴散法；細胞毒性；絲裂霉素C； 陽性對照材料

體外細胞毒性試驗是一種常用的體外毒性評價試驗，由于其成本低廉、試驗周期短、通用性好，而廣泛應用于醫療器械的毒性評價。細胞毒性試驗按照方法的不同可分為浸提液試驗、直接接觸試驗、間接接觸試驗三類[1]，其中，瓊脂擴散法作為間接接觸試驗中的一種，多應用于齒科材料的檢測[2]。目前常用的瓊脂擴散試驗陽性對照材料為苯酚稀釋液，但苯酚具有揮發性，會對試驗操作者帶來危害，且苯酚細胞毒性大、在瓊脂中擴散性過強，使得同一平皿中的不同樣品放置點會存在干擾。絲裂霉素c(Mytomycin c，MMc)是一種高效抗腫瘤化療藥物，具細胞毒性、水溶性較好、揮發性小[3-4]、價格相對低廉且不與瓊脂反應的特點。因此，我們以絲裂霉素c為試驗樣品，探討其作為瓊脂擴散法細胞毒性試驗陽性對照材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑

(1) 細胞株：L-929細胞（aTcc）

(2)試劑：胎牛血清(天津康源生物技術有限公司)、MeM培養基(coRNING)、2×RPMI 1640(吉諾生物醫藥技術有限公司)、胰酶/eDTa(Gibco)、瓊脂(鼎國)、中性紅(Solarbio Life Sciences china)、注射用水(石家莊四藥有限公司)。

3 g瓊脂溶于100 mL蒸餾水制成3%瓊脂溶液，高壓蒸汽滅菌后冷卻至48oc，將1份瓊脂與1份預熱至48oc的2×培養液混合，使培養基的最終濃度為1×培養基。

配制1%的中性紅水溶液，用磁力攪拌器攪拌1 h后，濾紙過濾，高壓消毒，2oc～8oc避光保存，使用前，用0.01 mol/L的PBS稀釋100倍成為0.01%中性紅染液。

(3) 對照材料：陰性對照為氯化鈉注射液（華潤雙鶴藥業股份有限公司）；陽性對照為苯酚（北京化學試劑公司）溶液，用蒸餾水配制20%苯酚溶液，過濾除菌。

(4) 試驗樣品絲裂霉素c(sigma)，加入注射用水后分別配制成2 mg/mL、1 mg/mL與0.5 mg/mL的溶液。

1.2 實驗方法

(1) 將配制好的2.5×105U/mL細胞懸液接種于直徑90 mm培養皿內，每皿加入10 mL，水平轉動培養皿使細胞均勻分散，置co2培養箱37 ℃培養24 h，形成近匯合單層細胞。

(2) 棄去培養液，將配制好的瓊脂培養基10 mL沿培養皿壁加入皿內，水平轉動培養皿使瓊脂培養基分布均勻并在室溫下凝固。每個培養皿內加入10 mL中性紅染液，置培養箱37oc避光保持15 min后棄去多余染液。

(3) 分別吸取0.01 mL樣品或對照材料溶液，加于直徑為5 mm圓形濾紙片中，將濾紙片放置在瓊脂表面。將培養皿置co2培養箱繼續培養24 h。

(4) 置顯微鏡下觀察試樣周圍及下方的細胞反應區域是否有溶解及褪色現象。參照表1進行結果判定。

表1 瓊脂擴散試驗細胞毒性反應分級Tab.1 Reactivety grades for agar diffusion test

2 實驗結果

培養24 h后，于倒置顯微鏡下可明顯看到陽性對照材料20%苯酚溶液試樣下面及周邊反應區域超出試樣1.0 cm以上，細胞溶解率大于80%。陰性對照材料氯化鈉注射液試樣周圍和試樣下方未觀察到反應區域。2 mg/mL絲裂霉素c組反應區域邊緣距試樣邊緣大于5.0 mm小于10.0 mm，細胞溶解率大于60%小于80%，毒性分級為3級；1 mg/mL絲裂霉素c組反應區域邊緣距試樣邊緣小于5.0 mm，細胞溶解度大于20%小于40%，毒性分級為3級；0.5 mg/mL絲裂霉素c組反應區域局限在試樣下方范圍，細胞溶解度小于20%，毒性分級為2級。實驗結果見表2。

表2 瓊脂擴散法樣品細胞毒性評價結果Tab. 2 Results of the agar diffusion tests

3 討論

瓊脂擴散法是一種半定量的細胞生物學方法，由于它具有快速、簡便、價廉、靈敏的特點，便于推廣應用，長期以來被廣泛應用并被ISo和各國標準化組織定為生物材料細胞毒性評價的標準實驗方法。尤其適用于牙科充填材料的細胞毒性評價，含有血清的瓊脂覆蓋層具有模仿牙本質層的仿生學特征[5]。而陽性材料則是指按既定的方法進行試驗時可重現細胞毒性反應的材料，其目的是驗證相應試驗系統的反應。由于瓊脂擴散法系統本身的局限性，陽性對照材料不能選擇無法通過瓊脂層擴散的可瀝濾物或與瓊脂反應的物質；瓊脂擴散法細胞毒性結果的評定是通過光學顯微鏡觀察細胞形態的變化及褪色范圍的大小，受主觀影響大，只能得到半定量化的實驗結果，因此陽性材料宜選擇細胞毒性反應級別大于2級的材料，以得到明確的結果。考慮到實際的試驗過程，陽性材料還需具有溶解性好、價格低廉、性質穩定、易于獲取等特點。

絲裂霉素c是從頭狀鏈霉菌培養液中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素，對多種癌癥有抗癌作用。絲裂霉素c可使細胞的DNa解聚，同時阻礙DNa的復制，從而抑制腫瘤細胞分裂，細胞毒性較強[6]，相對分子量為334.327，溶解性好，固體狀態性質穩定，較為容易獲取，可通過瓊脂層擴散且不與瓊脂反應，具有作為瓊脂擴散法細胞毒性評價的前提條件。

根據實驗結果，三種濃度的絲裂霉素c均呈現細胞毒性，且具有一定的量效關系。其中2 mg/mL濃度組褪色區邊緣距試樣邊緣大于5.0 mm小于10.0 mm，褪色區域明顯，易于觀察到；在直徑為90 mm培養皿中，不同褪色區域相互之間不會接觸或重疊；該組細胞溶解度大于60%小于80%，光學顯微鏡下可以觀察到明顯的陽性反應。1 mg/mL濃度的絲裂霉素c為中度毒性，但其反應區域面積小于2 mg/mL濃度組，考慮到試驗操作的可行性，及絲裂霉素c本身的價格相對低廉，可認為1 mg/mL濃度的絲裂霉素c作為陽性對照品的效果不及2 mg/mL組；0.5 mg/mL濃度的絲裂霉素c僅具有輕度細胞毒性，不適于作為陽性材料。

綜上所述，2 mg/mL的絲裂霉素c可作為瓊脂擴散法細胞毒性評價試驗的陽性材料。但需要注意的是，絲裂霉素c在水溶液狀態下并不不穩定，試驗時需要即用即配。

[1] ISo. ISo 10993-5: 2009 Biological evaluation of medical devices --Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity[S].

[2] 國家食品藥品監督管理局. YY/T 0127.9-2009 口腔醫療器械生物學評價 第二單元: 試驗方法 細胞毒性試驗: 瓊脂擴散法及濾膜擴散法[S].

[3] 曲秋蓮, 張英鴿, 楊留中, 等. 納米活性炭吸附絲裂霉素c腹腔化療的實驗研究[J]. 中華腫瘤雜志, 2006, 28(4): 257-260.

[4] 王堅, 林茂, 吳平, 等. 絲裂霉素c與表達Smac/DIaBLo的腫瘤靶向腺相關病毒聯用對抗惡性黑色素瘤的效果[J]. 西安交通大學學報(醫學版), 2012, 33(4): 460-465.

[5] 呂曉迎, 薛淼, 徐淑卿. 醫用高分子材料的體外細胞毒性研究[J].口腔材料器械雜志, 2000, 9(4): 205-207.

[6] 陳楠, 張杰, 徐敏, 等. 絲裂霉素c及紫杉醇對人胚肺成纖維細胞增殖及凋亡的影響[J].中華結核和呼吸雜志, 2013, 36(9): 655-660.

Study on the Applicability of Mytomycin C as a Positive Control Material for Agar Diffusion Cytotoxicity Test

【 Writers 】JIA Xuan1,2, WANG Rui1,2, SHI Jianfeng1,2, HE Xueying1,2
1 Beijing Institute of Medical Device Testing, Beijing, 101111
2 Beijing Key Laboratory of Medical Device Control, Beijing, 101111

agar diffusion, cytotoxicity, Mytomycin C, positive control material

R114

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.03.014

1671-7104(2016)03-0209-03

2015-12-04

賀學英，e-mail: hexueying@bimt.org.cn

【 Abstract 】Objective To find a non-volatile positive material control which showed moderately or severely cytotoxic and could be obtained easily. Methods The in vitro cytotoxicity study was conducted according to the agar diffusion method in ISO 10993.5-2009 and YY/T 0127.9-2001. Each sample was placed in contacted with the surface of an agar layer overlaying a monolayer of L-929 Mouse Fibroblast cells which were stained with neutral red vital stain at the bottom of the plate. As the sample, Mytomycin C was diluted to 2 mg/mL, 1 mg/mL and 0.5 mg/mL. Results In the group of 2 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 3. In the group of 1 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 3. In the group of 0.5 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 2. Conclusion 2 mg/mL Mytomycin C could be used as a positive material control of agar diffusion.