同型半胱氨酸對大鼠局灶性腦缺血后血管再生的影響

茍蕓，黃國偉，趙亞倩，陳爽，張緒梅

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同型半胱氨酸對大鼠局灶性腦缺血后血管再生的影響

茍蕓，黃國偉，趙亞倩，陳爽，張緒梅△

摘要：目的探討同型半胱氨酸（Hcy）對大鼠局灶性腦缺血后梗死灶周圍區血管再生的影響，為明確血管再生的抑制因素，促進大腦功能恢復奠定臨床基礎。方法將36只清潔級（SD）雄性大鼠隨機分為3組：假手術組（SO組）、大腦中動脈閉塞（MCAO）模型組（MCAO組）、MCAO+Hcy組，每組12只，SO組和MCAO組腹腔注射生理鹽水5mL/（kg·d），MCAO+Hcy組腹腔注射2%Hcy溶液5mL/（kg·d），預干預7 d后采用線栓法制作MCAO模型，于術后第7天處死取材，取材前3 d通過腹腔連續注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）。通過高效液相色譜（HLPC）法檢測大鼠血清中Hcy濃度，TTC染色觀察腦組織梗死灶區面積大小，采用免疫熒光染色法檢測梗死側丘腦BrdU+/lamini+細胞數目。結果MCAO+Hcy組大鼠血清Hcy濃度較SO、MCAO組顯著增高，腦組織梗死面積較MCAO組大，丘腦內BrdU+/laminin+細胞數目較MCAO組減少（P < 0.05）。結論體內Hcy濃度增高可增強腦梗死的損傷程度，并且抑制缺血區周圍部位的血管再生。

關鍵詞：腦梗死；疾病模型,動物；大鼠, Sprague-Dawley；同型半胱氨酸；血管再生

局灶性腦缺血可引起缺血區的神經病理性損傷，并導致缺血區周圍繼發性損傷，進而影響神經功能的恢復[1-2]。腦梗死發生后除了神經病理性改變外，在其預先存在的腦血管中可以長出新的毛細血管，此過程稱為血管再生，主要包括血管內皮細胞增殖及細胞外基質的降解[3]。一直以來，國內外學者對腦梗死的研究主要集中于局部缺血組織，而近年來，有研究者發現缺血區周圍組織的繼發性損傷對腦梗死后大腦神經功能的恢復同樣有重要影響，因而缺血區周圍繼發性損傷也日益受到重視[4-5]。研究表明，腦缺血可促進同側丘腦神經再生和血管再生[6]，故相應的促進血管再生或者消除抑制血管再生的因素有利于腦缺血患者的恢復。新近發現，血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）與腦梗死關系密切，可能是其新的獨立危險因素[7]。目前Hcy對腦梗死損傷發生機制的研究鮮有報道。本研究主要討論Hcy對局灶性腦缺血后血管再生的影響，為研究Hcy引起腦梗死的機制提供參考。

1　材料與方法

1.1動物分組與預干預成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號為SCXK（京）：2014-0008]，36只，體質量200～220 g。按照體質量分層，再用抽簽法將大鼠隨機分為假手術組（SO組）、大腦中動脈閉塞（MCAO）模型組（MCAO組）、MCAO+Hcy組，每組12只。SO組和MCAO組腹腔注射生理鹽水5mL/（kg·d），MCAO+Hcy組腹腔注射2%hcy溶液5mL/（kg·d），預干預7 d。

1.2方法

1.2.1MCAO模型的建立采用改良Longa法[8]，用10%水合氯醛，以3mL/（kg·d）劑量腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術臺上，于頸部正中切口，分離左側頸總、頸內和頸外動脈，結扎頸總、頸外動脈及其分支，在頸總動脈分叉處插入栓線深度約20mm，阻斷大腦中動脈，隨后以手術縫線固定栓線和頸內動脈。以手術后出現左側Honer征（瞳孔縮小、上眼瞼下垂、眼球內陷），右前肢癱瘓；麻醉清醒后，提尾懸空時右側前肢內收、屈曲，自主運動時身體向右側傾倒或轉圈的大鼠為造模成功。

1.2.2腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核昔（BrdU）為標記新增殖的細胞，各組大鼠按50mg/（kg·d）劑量于處死前3 d經腹腔注射BrdU（Sigma公司，美國），每日注射1次。

1.2.3高效液相色譜（high performance liquid chromatogra?phy，HPLC）法檢測血漿Hcy濃度取120 μL血漿和標準Hcy溶液，分別加入50 μL 1.43mol/L NaBH4溶液和8 μL正戊醇混勻，于冰上靜置30min；緩慢加入50 μL 0.6mol/L高氯酸，充分混勻，于室溫下靜置10min后13 000 r/min離心10min；取上清25 μL，依次加入5 μL 1.55mol/L NaOH溶液，63 μL 0.125mol/L硼酸鹽緩沖液，25 μL 1 g/L SBD-F溶液，混勻后置于60℃避光振蕩水浴60min，冰浴冷卻后上樣分析。色譜條件：柱溫為室溫，流動相為0.08mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0），流速1mL/min，洗脫時間40min，上樣量20 μL。熒光檢測激發波長390 nm，發射波長470 nm。

1.2.4TTC染色法計算梗死灶面積百分比各組大鼠取6只于MCAO術后第7天迅速斷頭取腦，腦組織置于-20℃冷凍30min后，從額極至枕極沿冠狀切成5個層面，每個層面的厚度為約2mm，置于2% TTC溶液中，37℃避光孵育30min；再放入4%多聚甲醛中固定過夜，拍照。采用Image-Pro-Plus 6.0軟件計算梗死灶體積（V）。V=t×（A1+A2+…+ An），t代表腦片厚度，A代表腦片梗死面積，梗死體積百分比=梗死體積/全腦體積×100%。

1.2.5腦組織石蠟切片制備取各組剩余6只大鼠，于MCAO術后第7天經10%水合氯醛麻醉，通過心臟灌注生理鹽水120mL，再用4%多聚甲醛灌注100mL，然后取出梗死側腦組織，于4%多聚甲醛中固定。梯度蔗糖脫水，常規石蠟包埋。將腦組織以梗死灶為中心冠狀切開，隔4取1，切片厚度為6 μm。

1.2.6免疫熒光雙標記檢測丘腦血管再生石蠟切片脫蠟至水，PBS（pH 7.4）洗3次后用2mol/LhCl及0.1mol/L硼酸溶液（pH 8.5）預處理，經3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶和抗原修復后用山羊血清封閉1h，滴加一抗混合液[兔抗大鼠laminin（1∶100，Abcam公司，美國）和小鼠抗大鼠BrdU （1∶100，Sigma公司，美國）]，4℃冰箱孵育過夜。PBS洗3次后滴加熒光二抗混合液（山羊抗兔FITC 1∶100，山羊抗小鼠TIRTC 1∶100），25℃避光孵育1h，用抗熒光衰減猝滅劑封片。陰性對照片不加一抗，采用PBS代替，其余步驟相同。熒光倒置顯微鏡（Olympus BX51，日本）拍片，圖像結果采用Image-Pro-Plus6.0軟件進行分析。

1.3統計學方法數據采用SPSS 19.0軟件進行處理，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，若組間差異有統計學意義，則采用SNK- q檢驗進行各組間多重比較。P < 0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組Hcy濃度比較HPLC結果顯示，與SO 組[（11.09±0.46）μmol/L]和MCAO組[（11.52±0.97）μmol/L]相比，MCAO+Hcy組[（17.38±0.47）μmol/L]大鼠血清Hcy濃度顯著增高（n=6，F=162.212，P< 0.05），表明MCAO+Hcy組大鼠體內Hcy富集，并形成高同型半胱氨酸血癥。

2.2Hcy對大鼠腦組織梗死灶的影響經TTC染色，SO組腦組織呈紅色，基本沒有梗死灶（0）。MCAO、MCAO+Hcy組梗死側腦組織皮質區可見明顯白色梗死灶，見圖1。MCAO+Hcy組梗死體積百分比為31.51%±0.98%，大于MCAO組的14.16%± 1.01%（n=6，F=2 256.778，P < 0.05）。

2.3Hcy對梗死側丘腦血管再生的影響結果顯示，正常大腦丘腦內BrdU+/laminin+細胞數較少（1.83±0.41），只有少量的新生血管。在MCAO術后第7天，MCAO+Hcy組梗死側丘腦內BrdU+/laminin+細胞數目（1.00±0.00）較MCAO組（13.33±0.48）顯著減少（n=6，F=235.367，P<0.05），見圖2。

3　討論

Hcy是蛋氨酸代謝過程中產生的一個重要中間產物。大量研究表明，體內Hcy濃度過高不僅可致動脈硬化，容易引起心腦血管疾病[9]，而且還與阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease, AD）、帕金森病（Parkin?son′s disease, PD）、抑郁癥和精神分裂癥等多種神經退行性疾病[10]和精神疾病密切相關[11]。本次研究通過腹腔注射Hcy使大鼠形成高同型半胱氨酸血癥，采用線栓法建立MCAO模型觀察Hcy對局灶性腦缺血后梗死灶大小的影響，發現Hcy可加重缺血后腦損傷的程度，進一步說明體內高濃度的Hcy具有一定的神經毒性作用，并影響腦缺血患者的預后。

局灶性腦缺血后可導致腦部供血不足，能使缺血區周圍的組織灌流得到改善的是在損傷部位新形成的側支血管[12]，損傷部位周圍的血管再生是改善腦缺血的一個關鍵環節，對于腦缺血的治療和預后有十分重要的作用。研究發現在缺血性腦卒中患者中，Hcy含量顯著升高[13]，但高同型半胱氨酸血癥導致腦血管病的機制尚不完全清楚，目前研究主要認為Hcy能氧化低密度脂蛋白、使血管平滑肌細胞增殖，動脈血管管壁纖維化，血栓沉積，動脈粥樣硬化形成[14-15]，進而導致心腦血管疾病發生，此外Hcy還與氧化應激有關[16]。Laminin是基底膜的重要組成部分，能夠參與細胞的代謝、存活、遷移、增殖和分化，免疫熒光標記體內laminin可反映血管密度[17]。此外，laminin與細胞增殖的標志物BrdU共標記可表示新增殖的血管內皮細胞。本研究發現MCAO+Hcy組laminin+/BrdU+細胞表達較MCAO組減少，說明Hcy可以抑制局灶性腦缺血后血管再生，從而影響腦缺血患者的恢復，即Hcy可能通過抑制血管再生而導致腦部供血不及時，抑制神經再生功能，使腦缺血患者梗死部位病變加重，阻礙自我修復。本研究將為Hcy引起腦梗死的機制探討提供參考。

（圖1、2見插頁）

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（2015-06-24收稿2015-07-25修回）

（本文編輯李鵬）

Effects ofhomocysteine on post-cerebral ischemic angiogenesis in rats

GOU Yun,hUANG Guowei, ZHAO Yaqian, CHEN Shuang, ZHANG Xumei△
Department of Nutrition and Foodhygiene, School of Publichealth, Tianjinmedical University, Tianjin 300070, China
△Corresponding Author E-mail：zhangxumei@tijmu.edu.cn

Abstract:Objective To explore the role ofhomocysteine（Hcy）on angiogenesis at peri infarct region after focal cere?bral ischemia in rats, to elucidate inhibitory factors of angiogenesis, and to establish a clinic foundation for clinical brain functional recovery.Methods Spragur-Dawley (SD)male rats (n=36) were randomly divided into three groups with 12 rats in each group including Sham Operation (SO) group,middle cerebral artery occlusion (MCAO) group andmCAO+Hcy group.The rats in Sham andmCAO groups were intra-peritoneally injected with 5mL/(kg·d) saline and rats inmCAO +hcy group were injected with 2% 5mL/(kg·d)hey solution from the same route.MCAO was introduced by intraluminal filamentmeth?od after 7 dhcy intervention.Rat brains wereharvested on the 7thday aftermCAO.BrdU（50mg/kg, as amarker of cell pro?liferation）was intraperitoneally injected three days before the rats were killed.High performance liquid chromatography （HPLC）was used tomeasure serumhcy concentration in rats.Brain infarction size was observed by TTC staining.Immuno?fluorescence staining was used to detect the number of BrdU+/laminin+cells at the thalamus of infarction side.Results Se?rumhcy concentration significantlyhigher inmCAO +hcy group than in SO andmCAO groups（P < 0.05）.Brain damage increased and the number of BrdU+/laminin+cells decreased inmCAO +hcy group compared with those ofmCAO group （P < 0.05）.ConclusionIncreasedhcy concentration in rats lead tomore severe damage of cerebral infarction as well as to inhibit the angiogenesis at surrounding ischemia area.

Key words：brain infarction；diseasemodels, animal；rats, Sprague-Dawley；homocysteine；angiogenesis

通訊作者△E-mail：zhangxumei@tijmu.edu.cn

作者簡介：茍蕓（1990），女，碩士在讀，主要從事營養與神經退行性疾病研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81373003）；中國博士后科學基金（2014M550148）

中圖分類號：R743

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59123

作者單位：天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系（郵編300070）