RLRs治療多發性硬化癥的研究進展

劉路，杜芳騰，文藝，張吉翔

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RLRs治療多發性硬化癥的研究進展

劉路，杜芳騰，文藝，張吉翔△

摘要：目前，多發性硬化癥（MS）的病因及其發病機制尚未清楚。RIG-Ⅰ樣受體(RLRs)是新發現的一類模式識別受體(PRRs)，位于細胞質內，可識別病毒雙鏈RNA的解旋酶，并通過自身的半胱天冬酶活化募集結構域（CARD）與干擾素β啟動刺激因子（IPS）-1發生相互作用，形成IPS-1信號小體，誘導干擾素Ⅰ型（Ⅰ-IFN）的表達，從而啟動免疫應答以及誘導抗病毒反應。研究發現，缺乏IPS-1的小鼠疾病將繼續惡化，伴隨高炎癥反應，從而加重軸突損傷和脫髓鞘病變。此外，若啟動免疫細胞上的RLRs，能緩解MS小鼠的炎癥并預防髓鞘的斷裂，從而降低麻痹的發生率。本文就RLRs治療MS的研究進展進行綜述。

關鍵詞：多發性硬化；干擾素Ⅰ型；綜述；RIG-Ⅰ樣受體；干擾素β啟動刺激因子

多發性硬化癥（multiple sclerosis,mS）是中樞神經系統(central nervous system, CNS)的炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，當MS的免疫細胞進入CNS的髓鞘并攻擊髓鞘和神經元時，可導致脫髓鞘和軸突損傷，臨床上表現為視神經炎、疲勞、麻木、肌無力、認知損傷等癥狀[1]。MS的病因及其發病機制至今尚不清楚，臨床普遍認為其與遺傳、免疫、環境因素如病毒感染等有關。有研究表明，RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰlike receptors，RLRs)作為Th1和Th17細胞在CNS中應答的負性調節劑，在大腦炎癥中起保護性作用，并建立了RLRs寡核苷酸類配體治療MS的方法[2]?，F就RLRs治療MS的研究進展綜述如下。

1　RLRs成員的結構及其信號通路

RLRs是抗病毒信號通路的胞內受體蛋白，主要包括視黃酸誘導基因（RIG）-Ⅰ、黑色素瘤分化相關基因MDA5和LGP2[3]。所有的成員都包括位于中心的DEX/DH解旋酶結構域、N末端結構域和C末端結構域（CTD）。在RLRs家族中，RIG-Ⅰ和MDA5均有2個特征性的CARD結構域位于N-末端，該結構域可與其他包含CARD的蛋白相互作用。解旋酶結構域保留著催化結合和水解雙鏈RNA（dsRNA）的三磷酸腺苷（ATP）酶解作用。CTD在與dsRNA結合時起著高親和力的作用，可編碼RIG-I中的阻遏域(repressor do?main，RD)。

當病毒RNA被RLRs信號識別時，RIG-Ⅰ和MDA5通過它們的CARDs和干擾素（IFN）-β啟動刺激因子(IPS) -1 的CARDs相互作用，從而啟動抗病毒信號，導致細胞核因子(NF) -κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki?nase，MAPK)激活，以及干擾素調節因子(IFN regulatory fac?tors，IRFs)對干擾素Ⅰ型（typeⅠinterferon，Ⅰ-IFN）、炎癥細胞因子的誘導作用開啟；IPS-1的跨膜結構域錨定到線粒體和過氧化物酶體上，IPS-1被證實有雙相抗病毒反應作用[4]。在過氧化物酶體膜上，IPS-1激活IRF1以及IRF3，導致選定的抗病毒基因迅速表達，并且立即觸發了Ⅰ-IFN抗病毒反應。在感染后期，位于線粒體膜的IPS-1可誘導IRF3/7激活，進而觸發Ⅰ-IFN表達，隨后通過上調Ⅰ-IFN受體信號的干擾素刺激因子（interferon-stimulated genes，ISGs）、Ⅰ-IFN誘導感染細胞以及非感染細胞的抗病毒狀態，啟動適應性免疫應答[5]。

現有研究表明，RLRs信號通路主要通過宿主蛋白誘導的翻譯后修飾（posttranslationalmodifications，PTMs）以及轉錄后構象變化進行調控[6]。泛素化以及磷酸化是其主要的PTMs[5]。RLRs信號其實是病毒RNA結合、發生構象變化和一系列翻譯后修飾的一個多步驟過程?，F已確定有多個轉錄后構象變化調節RLRs信號，包括miRNAs的降解以及小非編碼RNAs的降解，或者是靶因子mRNAs的翻譯抑制。正常情況下，PTMs可抑制RLR信號的一部分負反饋環路，防止抗病毒和促炎性因子誘導的蛋白過度生成。最近關于PTMs的研究發現，RIG-Ⅰ和MDA5信號狀態與RLRs信號在病毒感染和自身免疫性疾病的刺激下的激活有關[5]。

RLRs信號的激活可導致宿主細胞與病毒RNA結合，E3泛素連接酶介導K63連接RIG-Ⅰ的抑制結構域泛素化，從而使它們能與E3泛素連接酶、三基序蛋白25（tripartitemo?tif 25，TRIM25）和TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)相互作用，RIG-Ⅰ的N末端的CARDs通過TRIM25與賴氨酸-63連接泛素化，誘導RIG-Ⅰ寡聚化，與IPS-1相互作用，從而啟動下游信號并最終導致Ⅰ-IFN以及其他先天應答基因的轉錄。有研究證實，TRIM25合成K63-多聚泛素蛋白，該蛋白可直接結合到RIG-Ⅰ的CARD，介導下游信號結合到IPS-1，無需結合RIG-Ⅰ的泛素蛋白[7]。

2　RLRs的功能

PRRs除了參與免疫應答，還能夠調節細胞增殖、存活、凋亡及自噬，參與調節活性氧生成、細胞凋亡、血管生成，并因此產生組織重塑和修復。另外，RLRs還可識別細胞中的其他RNA以及激活抗病毒反應，包括Ⅰ-IFN的誘導、炎性激活、促炎細胞因子和趨化因子的表達。

在大多數組織中，RNA病毒在胞漿中被RLRs信號識別，隨后啟動級聯信號誘導Ⅰ-IFN的表達，從而產生抗病毒反應[8-9]。Yan等[10]研究顯示，小鼠卵巢顆粒細胞表達TLR3、RIG-Ⅰ、MDA5，它們共同介導卵巢細胞中的先天抗病毒反應，有助于防御卵巢病毒感染。有研究表明RLRs激動劑尤其是在限制病毒感染時可能產生顯著治療潛力[11]。在HCV感染的小鼠體外模型中，免疫細胞通過HCV RNA的病原體相關分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP）觸發RIG-Ⅰ信號激活，該過程能抑制HCV感染[12]。van Kasteren等[13]研究顯示動脈炎病毒（arterivirus）和內羅病毒（nairovirus）DUBs（deubiquitinating enzymes）的過度表達可抑制RIG-Ⅰ泛素化，認為RIG-Ⅰ有可能參與了應對動脈炎的感染過程。

病原微生物進入宿主體內后，宿主RLRs先識別病原微生物的特定組分PAMPs并且與其相互作用，隨后PRRs啟動特定的細胞內信號途徑的免疫應答，誘導各種自身防御基因的表達，進而參與炎癥反應及免疫反應[3]。近年來研究表明，RLRs信號通路在細菌感染中同樣發揮著重要的功能；與野生型小鼠相比，缺乏IPS-1的小鼠對感染不敏感并且顯示出較低的IFN-β表達，較高的Th1型細胞因子如IFN-γ和白細胞介素（IL）-12的產生和較低的Th2型細胞因子IL-4、IL-13的產生[12]。病原體致病菌的感染比鼠疫桿菌更易改變RLRs信號通路的表達，這表明RLRs信號通路是細菌感染中一條較為普遍的通路[14]。

3　RLRs與MS

最近研究表明，RLRs信號缺失的小鼠可加重CNS自身免疫性疾病[15]。目前已經證實，在MS患者的外周血細胞中RLRs信號活性增強；RLRs信號通路的遺傳改變可導致免疫應答缺陷，并且增加自身免疫性疾病的易感性[15]。研究發現，若啟動免疫細胞上的RLRs，能緩解MS小鼠炎癥并且預防髓鞘的斷裂，從而降低麻痹的發生率[2]。這可能涉及了疾病的多種保護機制，例如抗原的加工與遞呈、T細胞的抑制、細胞因子的調節、基質金屬蛋白酶及黏附分子的下調；以上這些均能夠抑制淋巴細胞遷移至血腦屏障。

3.1IPS-1與自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)mS是由Th1和Th17細胞誘導，是可直接抵抗CNS髓鞘少突膠質細胞的一種疾病。本病的組織學特點是：致腦炎性的Th1/Th17-誘導極化的CD4+T細胞、B細胞和大量髓樣細胞浸潤，從而導致嚴重的脫髓鞘，最終導致神經結構變性[16]。MS患者的標本中IL-1B、IL-18以及半胱天冬酶均有過度表達[17]。研究發現，缺乏IPS-1的實驗性EAE模型小鼠中的MS發病率達100%[2]。在缺乏IPS-1的脊髓中，脊髓普遍存在有過多巨噬細胞浸潤。一般情況下，增加IPS-1-/-小鼠脊髓中巨噬細胞的內向通入可導致興奮性T細胞數量增多，產生比IPS-1+/+小鼠更強的脫髓鞘改變；因此，在缺乏IPS-1所致嚴重的EAE中，MS的發生可能與Th1、Th17的轉移免疫應答有關，而同時Th2的反應仍可保持正常；此外，IL-17的主要產生者能通過IL-1β及IL-23通路放大Th17反應與自身免疫[4]。Suthar等[18]研究顯示，IPS-1-/-小鼠在先天免疫以及適應性免疫方面表現出嚴重的失調，并且易患神經感染，表現出對西尼羅病毒具有易感性。

3.2RLRs的活化Luber等[19]研究發現，RLRs差異性表達于特定的樹突細胞亞群，在CD4+和CD4?/CD8?樹突細胞中，RLRs可以在各種樹突細胞亞群起到抗原呈遞和產生細胞因子的作用。聚肌胞甘酸（polyinosinic-polycytidylic acid injec?tion，Poly IC）有輔助性增強體液和細胞免疫的作用，同樣自然殺傷細胞依賴的抗腫瘤性Poly IC是由TLR3、RIG-Ⅰ和MDA5識別。有研究顯示，在缺乏TLR3和RLRs信號通路的小鼠中，起增強Poly IC作用的抗原特異性抗體、抗原特異性CD8+T細胞和IFN-γ可完全缺失[20]，這表明TLRs和RLRs的組合性識別對于增強先天性和適應性免疫應答均必不可少。

目前研究發現，RLRs配體5′-三磷酸RNA寡核苷酸活化時，將會減少CNS的炎癥反應，可改善疾病的臨床癥狀；利用RIG-Ⅰ配體(3pRNA)或者Poly IC激活RIG-Ⅰ和MDA5時，所有的實驗組在疾病起始期和高峰期均有100%的發病率，并且在疾病高峰期時重復注射RIG-Ⅰ配體，可以明顯緩解臨床癥狀；同時疾病嚴重程度在RIG-Ⅰ和MDA5刺激的小鼠實驗效應階段是明顯減弱的[2]。

此外，de Rivero Vaccari等[21]研究表明，RIG-Ⅰ和MDA5的表達水平在脊髓損傷后6h顯著增加，而線粒體相關蛋白IPS-1在任何時間均沒有改變；增加的IFN-α和IFN-β同樣在脊髓損傷后6h檢測到，該研究認為脊髓損傷以及星形膠質細胞的牽拉損傷可刺激RLRs信號，然后通過IRF3磷酸化導致Ⅰ-IFN的產生[21]。另有研究顯示，在慢性病階段，脊髓中可見許多巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，而在RIG-Ⅰ和MDA5刺激的小鼠中它們的數量急劇減少，并且淋巴細胞和巨噬細胞數量在RLRs活化時亦減少[22]。

3.3RLRs通過IFN受體信號通路改善疾病細胞缺乏RLRs信號通路中的任何一部分將使其抗病毒反應缺失，反而增強病毒復制，表明RIG-Ⅰ和MDA5通過誘導先天免疫反應以及IFN信號擴增來控制病毒感染[11]。因此，RLRs和Ⅰ-IFN信號在CNS損傷誘發的炎癥反應中起著重要的作用。許多研究表明，RLRs改善疾病需要通過干擾素Ⅰ型受體（ⅠIFN receptor，IFNAR）通路傳遞[2,21]。研究發現，即使是使用RIG-Ⅰ及MDA5配體處理的IFNAR-/-小鼠，其EAE的臨床癥狀亦未見明顯改善；這說明RLRs信號通路改善疾病需要IFNAR的傳遞，并且IFN-β、IRF7、類泛素蛋白（ISG）15、UBP43、IL-27p28等在RLRs信號通路下被強烈誘導，同時MDA5的活化可能上調了Th17細胞相關因子如IL-1、IL-6、IL-23p19、轉化生長因子（TGF）-β、RORγT的表達[2]。

Kzlinke等[23]研究顯示，與IFNAR-/-的小鼠相似，RLRs信號缺失的小鼠CNS自身免疫性疾病的發生率顯著增加且病情加重，而野生型小鼠骨髓細胞觸發Ⅰ-IFN后，腦損傷減少。這表明RLR配體的治療效果可能與CNS內Th1、Th17 的T細胞反應的負性調節有關，觸發RLRs信號刺激內源性Ⅰ-IFN免疫調節有可能作為一種新的策略來治療MS。

RNA配體介導的疾病癥狀的改善是由可溶性因子如Ⅰ-IFN或者來自樹突狀細胞刺激產生的IL-27介導，這些因素最終抑制腦炎Th1和Th17的免疫反應[24]。和Th1細胞相比，Th17細胞更易受IFN-β的影響，這可能是由于IFNAR信號通路在Th17細胞中高表達所致[25]。因此，CNS自身免疫性疾病可通過RIG-I和MDA5抑制Th1和Th17細胞免疫，從而誘發Ⅰ-IFN應答——抑制T細胞膨脹和誘導T細胞凋亡[2]。

4　展望

綜上所述，通過PRRs誘導先天免疫反應是宿主防御致病因子的關鍵。然而，PRRs應答的異常激活與各種各樣的疾病緊緊相關，包括炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤等。因此，PRRs反應的負性調節對于維持內環境穩定至關重要。RLRs信號激活可誘導Ⅰ-IFN產生，從而抑制CNS中的自身免疫性炎癥和脫髓鞘，改善MS的臨床癥狀。目前RIG-Ⅰ的配體3pRNA為獨立的RNA序列，可影響Th1、Th17免疫反應調控。未來的研究可以將重點放在3pRNA的開發，它可以沉默Th1及Th17相關基因和激活RLRs信號。這種方法可能產生一種新的具有雙重功能的RNA分子，從而在治療自身免疫性疾病方面發揮重要作用。

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（2015-04-29收稿2015-07-17修回）

（本文編輯陸榮展）

Research progress on RLRs in the treatment ofmultiple sclerosis

LIU Lu, DU Fangteng, WEN Yi, ZHANG Jixiang△
Department of Gastroenterology，Second Afiliatedhospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China
△Corresponding Author E-mail: jixiangz@tom.com

Abstract:At present, the etiology and pathogenesis ofmultiple sclerosis are unclear.RIG-Ⅰ-like receptors are a new?ly discovered pattern recognition receptors (RLRs), which are located in cytoplasm.They can recognize thehelicase of viral dsRNAs, and interact with interferon beta promoter stimulator (IPS)-1 through their caspase activation recruitment domain (CARD), then form IPS-1 signalsome and induce the expression of interferon typeⅠ(Ⅰ-IFN), thereby initiate innate im?mune response and induce antiviral response.Recent studieshave found thatmice lacking IPS-1 would develop exacerbated disease and accompanied bymarkedlyhigher inflammation, increasing axonal damage and demyelination.Furthermore, initi?ating the RIG-Ⅰ-likehelicase receptor on the immune cells can alleviate inflammation andmyelin fracture inmultiple scle?rosis ofmousemodel, thus limit the incidence of paralysis.This paper is a review about the research progress on RLRs in the treatment ofmultiple sclerosis.

Key words:multiple sclerosis；interferon typeⅠ；review；RIG-Ⅰ-like receptor；IPS

作者簡介：劉路（1990），女，碩士在讀，主要從事上消化道出血危險因素的研究△通訊作者E-mail：jixiangz@tom.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81360074）

中圖分類號：R744.51

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/58834

作者單位：南昌大學第二附屬醫院消化內科（郵編330006）