接觸性DNA檢驗現狀與展望

吳 婷，牛青山，王金換，溫文嬌

（1.湖南警察學院，湖南長沙410138；2.中國刑警學院，遼寧 沈陽110035）

鑒定綜述
R e v i e w

接觸性DNA檢驗現狀與展望

吳 婷1，牛青山2，王金換2，溫文嬌2

（1.湖南警察學院，湖南長沙410138；2.中國刑警學院，遼寧 沈陽110035）

隨著犯罪嫌疑人的反偵查意識及能力加強，接觸性檢材在現場提取檢材中所占的比重越來越大，現場接觸性DNA在案件偵破中發揮的作用也日漸明顯。由于人在接觸物體后，會在物體表面留下相應的微量接觸性DNA，對這類接觸性檢材的檢驗分析是目前法醫物證檢驗工作的熱點和難點。對接觸性檢材的現場發現、前期處理及DNA的提取方法、擴增方法、電泳以及結果分析等方面對其檢驗研究進展綜述。希望能夠為偵查實戰工作在接觸類檢材的現場發現，提取以及成功檢測分型方面提供方法和思路。展望：首先，關于接觸性檢材的分類按接觸物體表面質地分更為合理，因為潛在DNA轉移的發生，與物體表面質地及樣本的濕度密切相關，而且檢材的表面質地很大程度上影響實驗者提取方法的選擇；其次，現勘人員應該及時出現場并且能結合案情科學地提取、包裝并運送檢材；再次，我們在處理接觸類檢材必須做到檢驗時突出重點部位、選擇合適的檢驗策略與方案；最后，根據接觸性檢材的檢測結果下鑒定意見時應十分謹慎。

法醫遺傳學；接觸性DNA；微量物證；DNA提取；PCR；STR分型

接觸DNA雖然微量但是側重于DNA的來源，因此并不等同于微量DNA（trace DNA、LCN或Lt DNA）。Gill等［6］認為微量DNA的模板量小于100pg；Caddy等［7］認為界定微量DNA模板量的標準為200pg；而Budowle等［8］報道由于DNA定量方法有差異，LCN分型應定義為正常閾值之下的分析結果；Gill等［9］后來發表類似于Budowle的觀點。由于在實際刑事案件中接觸性DNA的樣本原始情況脆弱且DNA含量很少，對這類樣本進行STR分型時仍需遵循微量DNA的分析方法。

1　接觸性DNA檢驗的研究現狀

1.1接觸性DNA檢材的現場發現

在案發現場，接觸性檢材與常規生物檢材如血痕、精斑相比，肉眼觀察很難判斷脫落細胞是否存在及其在載體上的具體部位、數量的多少。楊電等［10］研究表明用于指紋顯現的茚三酮薰顯技術可用于指導案件中人體脫落細胞的發現采集。而作為法醫現勘必備的多普勒光源，蔡能斌等［11］報道經波長為266 nm的紫外光照射后，會嚴重影響指紋脫落細胞的DNA檢驗，但對血跡、唾液斑、有毛囊的毛發的DNA檢驗影響較小。因此在現場勘查尋找發現接觸性檢材過程中應慎用紫外激光。張天祥等［12］報道了現場生物物證發現的指導策略，提供了一個系統的勘查思維。在接觸性DNA中應特別小心避免二次接觸的污染和轉移。現場發現接觸性的有效生物物證后，對其包裝和運送同樣會對接觸性DNA的檢測成功率產生巨大影響，因此現勘人員除了做必要防護措施，如戴口罩帽子手套，還要不輕易觸碰此類檢材，包裝時更要小心輕柔，必要時分區域包裝。

1.2接觸性DNA檢材的前期處理及DNA提取

1.2.1剪取法

煙蒂、紙巾、口香糖、甘蔗渣、檳榔渣等這類脫落細胞相對量大的載體檢材，可直接剪取適量放入EP管，例如，煙蒂可剪取過濾嘴的外層紙片大小約為1mm×5mm，口香糖剪取 1/2米粒大小；餐后擦嘴紙可剪取擦拭部位大小約5mm×5mm［4］。類似剪取法的還有陳曉暉等［13］報道的割取法提取一次性牙刷上的脫落細胞進行 STR分型效果良好，放置時間越長的牙刷，檢出率越低。

1.2.2擦拭法

第四，1988年推行政治體制改革后，戈爾巴喬夫對蘇聯政治形勢的發展在相當程度上處于失控狀態，被牽著鼻子走，不得不把主要精力花在處理不斷出現的社會政治問題上。僅1988年一年，就開了八次中央全會、兩次人民代表大會、兩次最高蘇維埃會議。在這樣的情況下，不可能集中精力來抓經濟和經濟改革問題。另外，在批判舊的政治體制時，又過多地糾纏歷史舊賬，強調不留歷史“空白點”，引發出一場又一場的大爭論，在爭論中又缺乏正確引導，導致對歷史否定過頭、人們思想混亂、黨的威信急劇下降，最終蘇共垮臺，使改革失去了堅強的政治領導核心。對出現的民族問題的復雜性、尖銳性又估計不足。這些情況，對蘇聯解體都起了作用。

飲料瓶口、果核、電話，工具握柄等這類載體檢材，可采用二步擦拭法［14］提取脫落細胞。Sukanya等［15］報道采用不同的拭子和濕潤劑的組合，從膠帶上脫落細胞中收集到DNA的量不同。Jennifer等［16］研究了志愿者洗手2小時后用主手食指在無菌塑料板上按了指紋，使用尼龍植絨拭子和直接PCR獲得完整的STR DNA圖譜，且尼龍拭子優于海綿拭子，海綿優于棉簽。

1.2.3吸附法

衣服、褲子，鞋子、帽子、手套等滲透性檢材可采用吸附法提取脫落細胞。如衣服、褲子類載體，用脫落細胞提取儀充分在衣領、袖口、腋窩、褲頭、口袋入口等直接接觸人體皮膚處吸取，手套類載體，翻轉后吸取內面的掌指部位，從脫落細胞提取儀上取下的三層濾膜分別用三個EP管處理。Goray等［17］報道與非滲透性載體相比，皮膚脫落細胞更容易沉積在滲透性載體上，而且滲透性載體不易發生二次轉移。邵武等［18］研究表明負壓吸附法，因具有良好的脫落細胞富集能力從而提高脫落細胞檢材的檢驗成功率。胡偉等［19］報道當載體受潮致人體脫落細胞浸潤載體后，即使是吸塵器法也因無法吸附足夠的人體脫落細胞而無法檢測成功，而采用改良標準QIAamp DNA Mini Kit法一次性過柱為反復多次過柱，能實現收集消化液中所有的DNA。

1.2.4粘取法

粘取法主要指利用膠帶或粘取器粘取的方法，趙春鶴等［20］發明的粘取器成功收集到粘附在衣服袖口、剪刀柄、水杯、手表，手套、鞋帶、拖鞋等20多份不同載體上的脫落細胞，并成功檢驗分型。Daly等［21］認為接觸性DNA用小膠帶粘取的收集檢測成功率，在木質，紡織物，玻璃三種載體依次降低。巴華杰等［22］研究表明對表面積較大的檢材，分區檢驗尤為重要，而采用先粘取表層，再吸取的方式，可以降低了背景DNA的影響，從而獲得了單一DNA分型結果。田蕊等［23］研究顯示EZ-Tape分區粘取法與真空負壓吸引法相比，更有針對性，能夠減少混STR峰型出現的幾率。

1.2.5單細胞顯微捕獲

胡蘭等［24］報道目前獲取微量甚至單個細胞的方法主要有流式細胞儀分離法、激光捕獲顯微切割分離法、顯微操作儀捕獲法等。顯微捕獲技術的關鍵在于鏡下上皮細胞和皮膚脫落細胞的準確區分。該技術的基礎在于人體不同部位被覆的上皮細胞是有區別的，如口腔、食道和陰道等腔面與皮膚表皮，前三者被覆的是未角化的復層扁平上皮細胞，有胞核，且胞質內含角蛋白少；而后者淺表細胞為角化的復層扁平上皮，無細胞核，且胞質內充滿角蛋白［25］。顧麗華等［26］利用激光捕獲顯微切割分離獲得了7～8個細胞的成功分型。曾憲海等［27］采用激光顯微切割技術、PALM系統收集接觸性檢材上的目標細胞。但是此方法操作繁瑣，儀器及技術要求更高，目前不能普遍應用于基層DNA實驗室。

1.2.6DNA的提取

成功檢測接觸性檢材的關鍵在于能否收集到盡可能多的脫落細胞用于DNA的提取。除了在檢驗時要突出重點部位，還要合理評估并恰當選擇微量DNA的提取方法。在國內外，有許多方法被報道應用于接觸性DNA的提取及純化，概括起來有Chelex法、磁珠法、有機溶劑法（有機法）、過柱法、硅珠法、硅膠膜法等。其中磁珠法還有半定量作用，7μL IQ磁珠約吸附100 ng的DNA。牛青山等［28］應用抗-DNA單克隆抗體免疫膠體金技術從溶液中直接捕獲微量DNA，形成DNA--免疫膠體金復合物沉淀，直接用于PCR反應，極大地提高了微量生物檢材DNA的檢測成功率。楊電等［29］報道采用小體積Chelex-100法可對60%左右的微量口腔脫落細胞檢材提取DNA并進行STR分型。而姚建等［30］采取增加取材量和在1.5mL離心管中大體系消化后用硅珠法純化DNA，能顯著提高檢驗成功率。

Sewell等［31］報道在對紙張接觸性DNA的提取上，DNeasy plant mini kit（QIAGEN）比QIAamp mini kit.更具優勢，某些紙張例如報紙，雜志，濾紙比普通辦公打印紙檢測成功率更高。楊電等［32］報道分別采用 95℃、70℃直接裂解和 TNE、SDS、PK預消化方式進行前處理接觸性檢材，磁珠法提取 DNA，有助于提高檢驗成功率。劉海渤等［33］報道磁珠法和改良磁珠法（MagAttract DNA MiniM48+Carrier RNA（cRNA））均能有效檢測接觸性檢材脫落細胞DNA，后者更優。其中，劉海渤研究結果的分型成功的標準是獲得個體性別基因座和9個STR基因座的明確基因型。

楊電［34］比較研究了經Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ國產磁珠法、有機法、Microcon過柱法等5種DNA提取純化方法處理后，進行PCR定量，每種DNA提取純化方法對接觸性DNA的回收率。楊電等［35］報道大部分接觸DNA檢材采用DNA IQ磁珠法結合MaxwellTM16自動儀可提取到足以進行STR分型的DNA。有報道國產磁珠結合自動化工作站批量提取接觸細胞檢材的成功率較低，故不提倡使用。

1.3接觸性DNA的擴增方法

正確的提取方法決定了檢驗是否成功，而接觸性DNA微量，應該選取適用的擴增方法，以達到最好的檢驗結果。接觸DNA進行STR檢驗時，對PCR條件進行改良，通過增加循環數、梯度擴增、模板濃縮、優化引物、調整反應體系、延長退火時間、改良緩沖體系、增加聚合酶量、使用針對降解DNA和微量DNA設計的mini-STR試劑盒等不同的方法來提高檢驗的靈敏度。

一般來說，通過增加PCR循環數，低至100pg的DNA樣本均能獲得STR分型結果。Sangeeta等［36］報道接觸DNA樣本中，LCN型（增加額外循環）和miniSTR聯用的策略可得到滿意的結果。Luke等［37］認為使用28循環+純化+多進樣的方法能得到相同或更好的數據。NFI改良了28次循環的實驗方案，他們在28次循環之后，加入新鮮的DNA聚合酶，繼續擴增6次［38］。這種28+6的方法使我們能檢測到28次循環擴增產物，從而避免34次強化循環生成的過量DNA用于檢測。Seung等［39］報道低溫退火及延伸的步驟會降低stutter比例，低溫PCR：Identifiler擴增，32循環，56度退火，56度延伸。

直接擴增法在接觸性檢材上的運用也有報道，毛坤云等［40］報道載體法可提高微量生物檢材中DNA檢出率。商業化的直擴試劑盒具有抗污染能力強，擴增時間短，適應檢材廣泛等特點。李長征等［41］研究表明Identifiler Direct試劑盒直擴法用于接觸性DNA成功率明顯高于常規Chelex提取法。

全基因組擴增（whole genome amplificationWGA）技術。Lasken等［42］報道對納克級別的微量樣本而言，WAG技術可能在一定程度上能達到富集樣本的目的，但在皮克級別，其并非良策。該實驗成本較高，無法在基層實驗室普及使用。

1.4接觸性DNA的電泳及結果分析

在電泳時，通過增大注樣電壓和延長注樣時間，提高毛細管電泳的PCR產物進樣量，也能提升檢測靈敏度。另外，還有關于PCR產物純化的方法，使毛細管電泳的信號得以增強。由于通過電動進樣，注入毛細管電泳儀的DNA的量與樣品中的鹽含量成反比，因此PCR產物的純化這一步就是為了降低電泳前樣品中鹽含量。目前，實驗室普遍采用的是低導電性的甲酰胺稀釋樣本。也有專門的試劑盒供選擇，如：MinElute試劑盒（QIAGEN）、Montage試劑盒（Millipore）、Performa DTR凝膠濾柱（Edge BioSystems）。

接觸性材作為低拷貝（LCN）DNA中的一種，檢出結果可能出現等位基因漏檢、插入、不均衡擴增等現象，因此在判斷接觸性檢材STR分型時必須謹慎，要觀察等位基因的RFU值、信噪比，同時應該設置陽性、陰性對照來監測實驗數據的可靠程度。Sangeeta等［43］認為重復分型結果的比較用可來識別偽峰，并提供一個完善的圖譜，重復擴增確認一致性是必需的。在進行接觸性檢材DNA結果報告時可以參照John［38］的微量DNA樣本分析的注意事項和挑戰。

2　接觸性微量物證DNA檢驗存在的不足及展望

國內外對于接觸性DNA檢驗的研究做了大量工作，但是接觸性檢材的檢驗成功率仍然不高。首先，對現場接觸性檢材的發現不能做到及時或有效，現勘人員應該及時出現場并且能結合案情科學地提取、包裝并運送檢材。其次，對于極微量的接觸性檢材沒有完全行之有效的提取方法，在處理接觸類檢材必須做到檢驗時突出重點部位、選擇合適的檢驗策略與方案。目前，接觸性檢材所含DNA可以用于成功檢測的量的范圍并無文獻報道。最后，對于接觸性檢材的結果分析仍然是難點，并且由接觸性檢材DNA模板分析獲得的圖譜，也未必與案件有關，有可能是案發前就已遺留，所以根據接觸性檢材的檢測結果下鑒定意見應十分謹慎。

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（本文編輯：李成濤）

Advances in Touch DNA Testing

WU Ting1，NIU Qing-shan2，WANG Jin-huan2，WEN Wen-jiao2
（1.Hunan Police Academy，Changsha 410138，China；2.National Police University of China，Shenyang 110035，China.）

With the increasing counter-investigation awareness and capacity of criminals，touch DNA has larger proportion in the samples collected at crime scenes，and is gradually playing a more obvious role in solving cases.People leave trace DNA on the surface when they touch an object.The touch DNA testing is the focus and difficulty of forensic biology research.The authors review the studies of touch DNA in the following aspects:the discovery and dispose of contact samples on the scene，the method for DNA extraction and amplification，electrophoresis，and analysis methods.Moreover，the authors rasies their own opinions:First，it is more reasonable to classify the touch DNA by the surface texture of the objects，not only because the transfer of potential DNA is closely related to the material quality and the humidity of samples，but also because the material quality greatly affects the choice of extraction methods.Secondly，the investigators should arrive at the crime scene in time，and collect，pack and submit the samples scientifically under specific conditions. Thirdly，the analysts must know the key parts in examination，and choose appropriate analyzing methods.Lastly，the conclusions drawn from the testing result of touch DNA should be very cautious.

forensic genetics；touch DNA；trace biological evidence；DNA extraction；PCR；STR genotype

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.011

1671-2072-（2016）05-0066-05

2016-03-21

吳婷（1988—），女，助教，碩士，主要從事法醫物證學研究。E-mail:ya.tsing@163.com。