高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜法篩選產溶血磷脂酸芽胞桿菌

鄭雪芳，陳 崢，劉 波，朱育菁，史 懷

(福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建 福州 350003)

高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜法篩選產溶血磷脂酸芽胞桿菌

鄭雪芳，陳 崢，劉 波*，朱育菁，史 懷

(福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建 福州 350003)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一種重要細胞外信號遞質和細胞內第二信使。本研究采用高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜(HPLC-QTOF-MS)技術對34株不同種類芽胞桿菌的代謝物進行測定。結果表明，供試的菌株中只有1株枯草芽胞桿菌BacillussubtilisFJAT-8784的代謝物中檢測出產溶血磷脂酸，與Metlin代謝物質譜數據庫中溶血磷脂酸的匹配得分達96.73，該化合物的質子化分子離子[M+H]+質荷比為439.281 9，質量數為438.275 8，推斷出其分子式可能為C21H43O7P，其相對含量占發酵上清液總代謝物的1.32%。

芽胞桿菌；溶血磷脂酸；高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，化學結構：1-酰基-2-羥基-3-磷酸甘油(1-acyl-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphate)，CAS：944265-88-7。LPA是溶血磷脂的活性成分之一，為一種重要細胞內第二信使，對細胞的生長、增殖、分化及細胞內信息傳遞產生多種影響，在維持機體正常的生理功能，參與各種病理過程的發生發展均有著重要的作用[1]。美國羅德島大學(university of Rhode Island)的研究人員發現LPA通過干擾病原菌生物膜的形成，可千倍增強抗生素效果，使得一些較老的β-內酰胺類抗生素能再次使用，而且可降低抗生素的使用劑量[2]。Zhang等[3]研究了LPA抗乳房癌的特性，Schleicher等[4]研究了LPA抗輻射敏化作用，Nikitopoulou等[5]研究了LPA治療關節炎作用。

關于溶血磷脂酸來源主要采用化學合成和酶法合成，Jiang等[6]研究了PLA的選擇性合成。陳家華等[7]研究了溶血磷脂酸(LPA)的化學合成方法，通過合成重要中間體2-O-芐基甘油，接著先進行脂肪酰化，然后用氯代磷酸二苯酯作為磷酰化試劑進行磷酰化，最后用PtO2/H2這一還原方法將芐基和苯基同時還原去保護，得到了目標分子——酰基LPA，與此同時，利用相似的方法，醚鍵LPA也被成功地合成。關于微生物產生LPA研究報道較少，Hara等[8]報道了枯草芽胞桿菌甘油醛3-磷酸(sn-glycerol-3-phosphate (G3P))代謝過程發現LPA的產生，Lu 等[9]發現了肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae細胞膜磷脂合成過程產生LPA。

高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜(HPLC-QTOF-MS)聯用技術是20世紀70年代發展起來的一門綜合性分析技術，具有高分離能力、高靈敏度、應用范圍廣和極強的專屬性等特點[10]。本研究利用HPLC-QTOF-MS法對福建省農業科學院農業生物資源研究所保存的不同種類及地理來源的芽胞桿菌進行溶血磷脂酸(LPA)普篩，篩選出具產生LPA的芽胞桿菌，為具有活性芽胞桿菌代謝物的進一步開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的34株不同種類的芽胞桿菌由福建省農業科學院農業生物資源研究所保存(表1)。芽胞桿菌的固體培養基為LB，購買自上海生工。發酵培養基為胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)，購買自美國BD公司。試驗試劑：色譜純乙腈購買自美國JT Baker公司；色譜純乙酸銨(CNW)購買自上海安譜科學儀器有限公司。試驗儀器：液相四級桿飛行時間質譜聯用儀Agilent 1260/6520為美國安捷倫科技公司生產。

表1 供試芽胞桿菌菌株Table 1 Bacillus strains used

(續上表)

1.2 試驗方法

發酵液制備: 供試芽胞桿菌在LB培養基上活化，30℃培養24 h后，轉接至20 mL LB種子培養基中，30℃、180 r·min-1振蕩培養12 h，為種子液。取種子液按1%接種量接入TSB液體培養基中，30℃、180 r·min-1振蕩培養48 h。將發酵液密封，4℃冰箱中備用。樣品制備：取50 mL 芽胞桿菌發酵液，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜后，轉置GC小瓶，4℃冰箱保存備用。

HPLC條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Extend C18(2.1 mm× 50 mm， 1.8 Micron)，柱溫35℃，進樣量為2 μL。流動相：A液為10 mmol·L-1的乙酸， B液為乙腈；流速為0.2 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～3 min為90% B和10% A，3～25 min為50% B和50% A，25～35 min為90% B和10% A。QTOF-MS運行條件：正離子模式，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為5 L·min-1，霧化器壓力為30 psig，毛細管電壓為3 500 V，裂解電壓為175 V，Skimmer為65.0 V，質量范圍：150～1 000 m·z-1。

2 結果與分析

2.1 產溶血磷脂酸芽胞桿菌的篩選

利用HPLC-QTOF-MS技術檢測到供試的34個不同種類芽胞桿菌中只有1株產溶血磷脂酸，為枯草芽胞桿菌FJAT-8784，其他菌株暫無檢出該成分。菌株FJAT-8784的溶血磷脂酸與Metlin代謝物質數據庫檢索到的溶血磷脂酸匹配得分為96.73。枯草芽胞桿菌FJAT-8784胞外代謝物中溶血磷脂酸相對含量占其發酵上清液總代謝物的1.32%。

2.2 芽胞桿菌來源的溶血磷脂酸成分分析

采用HPLC-QTOF-MS技術對34株不同種類芽胞桿菌發酵上清液中的代謝物進行測定后，利用Mass Hunter軟件，對原始數據進行分子特征提取，然后將它們在Metlin代謝物質譜數據庫中進行檢索比對而獲得各代謝物的信息。結果表明，從枯草芽胞桿菌FJAT-8784的發酵上清液中檢測出溶血磷脂酸(LPA)，色譜圖顯示其特征峰的保留時間為25.90 min，離子響應度為5.90×105(圖1)。FJAT-8784中LPA的掃描質譜圖(圖2)和分子特征提取質譜圖(圖3)提供了相應同位素峰的相對豐度和同位素峰的間距。

采用正離子模式電離，正離子模式下產生 [M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+等，根據表2化合物鑒定結果顯示，化合物的質子化分子離子[M+H]+質荷比為439.281 9，因而該成分質量數為438.275 8，進而推斷出其分子式可能為C21H43O7P，該化合物名稱為溶血磷脂酸(LPA)，其分子結構見圖4。

表2 化合物鑒定結果Table 2 Identification of related compound

3 討論與結論

LPA主要來源于血小板，具有生長激素樣效應，在各項細胞效應中起重要的信號轉導作用[11]。LPA主要功能有以下幾點：(1)促進細胞有絲分裂。Dunlop等[12]在人胰島細胞上發現LPA能激活細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)，促進其與四環素D1(cycline D1)形成復合物，使細胞從G1期轉入S期；(2)抗細胞淍亡。Murph等[13]首次報道LPA與Gi偶聯受體結合，可以抑制胱門蛋白酶(caspases)的活性，上調細胞凋亡相關基因Bcl-2的表達，使致癌基因與抑癌基因比例失調，腫瘤細胞淍亡數目下降；(3)影響神經細胞形態。張兆輝等[14]證明LPA具有明顯的劑量信賴性的神經毒性作用，可誘導細胞內合成活性氧(ROS)形成而發生氧化應激導致神經元凋亡。

關于細菌產溶血磷脂酸的研究報道較少，Hiraoka等[15]報道枯草芽胞桿菌RB14能產LPA。Hara 等[8]研究枯草芽胞桿菌甘油醛3-磷酸(sn-glycerol-3-phosphate (G3P)酰化過程，發現了LPA的產生。Lu等[9]發現了肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae代謝過程合成LPA。有關芽胞桿菌產LPA的研究報道較少。芽胞桿菌種類多、數量大、能產生多種生物活性物質，已在工農業、醫藥衛生、環保等領域得到廣泛應用[16]。因此，從芽胞桿菌中尋找LPA產物，為開發新型天然的LPA制劑提供很好的條件。本研究在芽胞桿菌產溶血磷脂酸菌株篩選中，使用了HPLC-MS聯用技術，相較于傳統研究方法，具有高通量、高靈敏度、高分辨率及強大的定性分析能力，適用于大量樣品的研究。本研究充分發揮技術優勢，實現對產溶血磷脂酸芽胞桿菌菌株的快速篩選，結果表明在供試的34種芽胞桿菌，包括枯黃芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等，只有1株枯草芽胞桿菌FJAT-8784能產次生代謝物LPA，這也印證了Hiraoka等的研究，本研究的LPA色譜圖顯示其特征峰的保留時間為25.90 min，離子響應度為5.90×105，與Metlin代謝物質數據庫的溶血磷脂酸匹配得分較高，為96.73，分子式為C21H43O7P，相對含量較高，為1.32%。產溶血磷脂酸枯草芽胞桿菌篩選，使得利用芽胞桿菌作為生物反應器生產LPA成為可能，拓展了LPA來源途徑，為生物活性物質LPA的利用奠定基礎，有關芽胞桿菌產溶血磷脂酸的代謝機理和應用范圍有待進一步研究。

[1]何蘭杰. 溶血磷脂酸——一種具有多種生物學功能的磷脂信號分子[J]. 細胞生物學雜志, 2000, 22(3): 121-126.

[2]KROGFELT K A, UTLEY M, KRIVAN H C, et al. Specific phospholipids enhance the activity of β-lactamantibiotics againstPseudomonasaeruginosa[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000, 46: 377-384.

[3]ZHANG H L, XU X Y, GAJEWIAK J, et al. Dual activity lysophosphatidic acid receptor Pan-Antagonist/Autotaxininhibitor reduces breast cancer cell migration in vitro and causes tumor regression in vivo [J]. Cancer Research, 2009, 69: 5441.

[4]SCHLEICHER S M, THOTALAL D K. Autotaxin and LPA receptors represent potential molecular targets for the radiosensitization of murine glioma through effects on tumor vasculature [J]. PLoS ONE, 2011, 6(7): e22182.

[5]NIKITOPOULOU I, KAFFE E, SEVASTOU I, et al. A metabolically-stabilized phosphonate analog of lysophosphatidic acid attenuates collagen-induced arthritis [J]. PLoS ONE, 2013, 8(7): e70941.

[6]JIANG G, XU Y, FUJIWARAY, et al. Alpha-substituted phosphonate analogues of lysophosphatidic acid (LPA) selectively inhibit production and action of LPA [J]. ChemMedChem, 2007, 2(5): 679-690.

[7]陳家華, 張延東. 酯鍵溶血磷脂酸和醚鍵溶血磷脂酸的全合成[J]. 北京大學學報：自然科學版, 2003, 39(2): 151-157.

[8]HARA Y, SEKI M, MATSUOKA S, et al. Involvement of PlsX and the acyl-phosphate dependent sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase PlsY in the initial stage of glycerolipid synthesis inBacillussubtilis[J]. Genes Genet Syst, 2008, 83(6):433-442.

[9]LUY J, ZHANG Y M, GRIMES K D, et al. Acyl-phosphates initiate membrane phospholipid synthesis in gram-positive pathogens [J]. Molecular Cell, 2006, 23: 765-772.

[10]孟兆玲, 齊元英, 柳仁民. 高效液相色譜-質譜聯用技術的應用進展[J]. 化學分析計量, 2006, 15(6):99-102.

[11]TANGKIJVANICH P, MELTON A C, SANTISKULVONG C. Rho and p38 MAP kinase signaling pathways mediate LPA-stimulated hepatic myofibroblast migration [J]. Journal of Biomedical Science, 2003,(10): 352-358.

[12]DUNLOP M, MUGGLI E, CLARK E. Association of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1 in neonatal cells after mitogenic stimulation by lysophosphatidic acid [J]. BiochemBiophys Res Commun, 1996, 218: 132-136.

[13]MURPH M, MILLS G B. Targeting the lipids LPA and SIP and their signaling pathways to inhibit tumour progression [J]. Expert Reviews in Molecular Medicine, 2007,(9): 1-18.

[14]張兆輝, 衛濤濤, 余紹祖, 等. 溶血磷脂酸損傷小腦顆粒神經元并誘導細胞凋亡[J]. 卒中與神經疾病, 2004, 11(6): 321-324.

[15]HIRAOKA H, ASAKA O, ANO T, et al. Characteristics ofBacillussubtilisRB14, coproducer of peptide antibiotics iturin A and surfactin [J]. Journal of General and Applied Microbiology, 1992, 38(6): 635-640.

[16]SANAHUJA G, BANAKAR R, TWYMAN RM, et al.Bacillusthuringiensis: a century of research, development and commercial applications [J]. Plant Biotechnology Journal,2011, 9:283-300.

(責任編輯：林海清)

Screening Lysophosphatidic-acid-producingBacillusUsing HPLC and Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry

ZHENG Xue-fang, CHEN Zheng, LIU Bo*, ZHU Yu-jing, SHI Huai

(AgriculturalBio-ResourcesInstitute，FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003，China)

Lysophosphatidic acid (LPA) is an important extracellular signal transmitter and intracellular secondary messenger. Metabolites in the supernatants of liquid culture media for 34 strains ofBacilluswere determined by using HPLC and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. It was found that the onlyB.subtilisstrain that produced LPA was FJAT-8784. The obtained LPA showed a matching score of 96.73 according to the Metlin database. It had a molecular weight of 438.2758, and a mass to charge ratio of 439.2819. Consequently, the chemical formula for the isolated LPA was assumed to be C21H43O7P. In the supernatant, the total metabolites contained approximately 1.32% LPA.

Bacillus; lysophosphatidic acid; HPLC/quadrupole time-of-flight mass spectrometry

2016-05-23初稿；2016-09-08修改稿

鄭雪芳(1977-)，女，博士，副研究員，主要從事植物病害生物防治的研究(E-mail:zhengxuefangfz@163.com) *通訊作者：劉波(1957-)，男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術及農業生物藥物研究(E-mail：Fzliubo@163.com)

國家自然科學基金(31370059)；福建省自然科學基金項目(2015J01103)；福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1018-8)

Q 545

：A

：1008-0384(2016)11-1252-05

鄭雪芳，陳崢，劉波，等.高效液相色譜/四級桿飛行時間質譜法篩選產溶血磷脂酸芽胞桿菌[J].福建農業學報，2016，31(11)：1252-1256.

ZHENG X-F，CHEN Z，LIU B，et al.Screening Lysophosphatidic-acid-producingBacillusUsing HPLC and Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1252-1256.