絲狀真菌里氏木霉中shRNA沉默紅色熒光基因

李潔璇，劉雯莉，梁智成，王紹文，梁秀怡，佘煒怡，劉剛，田生禮*

(1.深圳大學生命科學與海洋學院深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060; 2.深圳市海洋生態與生物資源重點實驗室深圳大學，廣東深圳518060)

絲狀真菌里氏木霉中shRNA沉默紅色熒光基因

李潔璇1，劉雯莉1，梁智成2，王紹文2，梁秀怡1，佘煒怡1，劉剛1，田生禮1*

(1.深圳大學生命科學與海洋學院深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060; 2.深圳市海洋生態與生物資源重點實驗室深圳大學，廣東深圳518060)

報道了在里氏木霉中建立的一種以紅色熒光蛋白(DsRed)為報告基因的RNA干擾方法。首先，將構建的表達DsRed質粒pANRed1轉化里氏木霉QM9414，得到抗潮霉素B抗性并能穩定表達DsRed的菌株DsRed-T.reesei。其次，以丙酮酸脫氫酶啟動子Ppdc和纖維二糖水解酶I終止子cbh I為原件，克隆到載體pPHL上構建質粒pPHL-Ppdc-Tcbh1。根據DsRed基因序列設計特定的siRNA干擾序列和另一條無同源序列的siRNA作為陰性對照，克隆到載體pPHL-Ppdc-Tcbh1得到重組質粒。將其轉化到DsRed-T.reesei中，用含有100 μg/mL潮霉素B和250 μg/mL腐草霉素的PDA平板篩選轉化子。結果表明，約79%的轉化子出現紅色熒光沉默現象，其中一些轉化子DsRed的表達幾乎完全被抑制。熒光定量PCR和Western印跡分析顯示DsRed基因的表達受到不同程度的下調。以上結果提示，在里氏木霉中可用此方法研究基因表達調控。

RNA干擾;shRNA;紅色熒光蛋白DsRed;里氏木霉

KeywordsRNA interference;shRNA;DsRed;Trichoderma reesei

里氏木霉是一種絲狀真菌，廣泛應用于水解酶的生產［1］，在生物降解中具有十分重要的作用。里氏木霉主要生產纖維素酶和纖維二糖水解酶I (CBHI)，能合成大約64%～80%的胞外蛋白［2］。里氏木霉除了具有優越的蛋白分泌能力外，還能對蛋白進行糖基化修飾和翻譯后修飾。因此，里氏木霉是重組蛋白表達和生產的優良宿主。先前通過誘導突變使得里氏木霉的纖維素酶產量顯著提高，但通過此方法很難進一步提高產量。隨著里氏木霉基因組測序結果的發布，使通過基因工程方法改良生產纖維素酶菌株成為可能［3］。因此，引入一種高效的基因操作手段來研究里氏木霉中纖維素酶和半纖維素基因的調控機制是可行的。在細胞、酵母和真菌中，RNA干擾是一種高效的基因沉默手段［4-7］。以基因家族中的保守序列為靶目標，RNA干擾可應用于沉默同源基因，或者從不同基因獲得的嵌合序列為靶目標沉默非同源基因［8］。以綠色熒光蛋白GFP或紅色熒光蛋白DsRed為報告基因的RNA干擾體系已在絲狀真菌中發展起來［9-10］。在真菌中發現的第一種siRNA是用于沉默與內源基因具有同源性的外源序列［6］。據報道，合成外源的dsRNAs或者內部轉錄合成的dsRNAs在真菌內都能有效的沉默基因［8］。另外，dsRNAs由可誘導的啟動子起始轉錄，能在特定的階段研究基因表達情況［11］。絲狀真菌通常含有多細胞、多核菌絲，使基因打靶的效率低。因此，RNA干擾為絲狀真菌提供了一種可用于基因敲除的通用靈活手段，其中包括里氏木霉［12-13］。為了研究真菌基因的功能或提高工業菌株的特性，研究者利用各種基因操作方法在真菌體內通過同源重組破壞靶基因的完整［1，14］。然而，在許多類型的真菌中，由于轉化DNA的異位整合導致［15-16］同源重組的效率通常很低，大約在0～40%不等。所以，在絲狀真菌中單獨敲除一個靶基因是一項艱難的工程，引入一些基因操作手段如RNA干擾是十分必要的。我們已在絲狀真菌康氏木霉YC01中成功建立RNA干擾體系。體系主要由一個表達盒組成，包括里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子gpd和纖維二糖水解酶I終止子cbh1，還有一個帶有內含子的發夾RNA(ihpRNA)［9］。其中包含2個430 bp的DsRed片段和一個209 bp的間隔片段，間隔片段來源于里氏木霉egl2基因的內含子2。這3個片段通過overlap PCR相連，接著插入到載體pPHL上得到重組質粒pPHL-Redi。本研究以DsRed為報告基因，獲得能有效應用于工業菌株絲狀里氏木霉QM9414的siRNAs，以期在DsRed-T.reesei菌株中以DsRed特定序列為靶目標的19ntsiRNAs能有效沉默DsRed的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒大腸埃希菌DH5α(supE44 ΔlacU169(F80 lacZ ΔM15)hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)用于構建質粒，大腸埃希菌Top10F'(Invitrogen)用于載體構建和保存。質粒pANRed1從pAN7-1(GenBankaccession，Z32698)改造得到［9］。質粒pUC-19(GenBank accession，M77789)用于構建重組質粒pPHL。將質粒pAN-Red1轉入里氏木霉QM9414(ATCC 26921)得到重組菌株DsRed-T.reesei。

1.1.2 培養基LB培養基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，用于平板培養時加入15 g/L瓊脂，用于E.coli轉化時加入100 μg/ mL氨芐青霉素(Invitrogen，美國，加利福尼亞)。PDA培養基:取馬鈴薯200 g，去皮切碎后加至約1 L蒸餾水中，煮沸30 min，用4層紗布過濾，收集濾液。加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂后定容至1 L，滅菌倒平板。進行T.reesei轉化子篩選時加入100 μg/mL潮霉素。基本培養基:KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41.4 g/L，尿素0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 7 g/L，CoCl2· 6H2O 0.003 7 g/L，蛋白胨2 g/L，吐溫80 1 g/L以及葡萄糖20 g/L。

1.1.3 試劑限制性內切酶、DNase I購于Fermentas公司，哈茨木霉溶壁酶購于Sigma-Aldrich公司，RNA提取試劑盒購于BioTeke公司，反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq購于Takara公司，DsRed單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP和Anti-alphaTubulin購于艾美捷公司，Bradford試劑及其他試劑購于生工生物工程公司，其他試劑均屬于分析純。1.1.4儀器高壓自動滅菌鍋(Hirayama，HVE-50);超凈工作臺(蘇州凈化設備總廠，SW-CJID);熒光定量PCR儀(Applied Biosystem，ViiATM7);PCR儀(ABI，2720);冷凍離心機(Thermo Scientific，Multifuge XIR);小型離心機(Eppendorf，Minispin);pH計(Mettler-Toledo，320-S);電泳儀(Amersham Pharmacia，EPS-601);水平電泳槽(北京六一，DYCP-31D);高純水儀(力新儀器有限公司，Heal force ROP3);核酸成像系統(Bio-Rad，GEL DOX XR+);低溫搖床(上海蘇坤，SKY-200B);低溫培養箱(上海愛朗，LTI-700);奧林匹斯BX51TRF System(東京，日本)。

1.2 方法

1.2.1 RNAi載體的構建使用引物PHL-F和PHL-R(見表1)，利用pPHL-Redi載體為模板，通過PCR擴增出腐草霉素抗性基因表達盒PHL (2 784 bp)，同時引入酶切位點Hind III和Pst I。經過雙酶切后，插入經相同酶切的載體pUC-19中得到重組質粒pPHL［9］。以里氏木霉基因組DNA為模板，Ppdc-F和Ppdc-R(表1)為引物PCR擴增出丙酮酸脫羧化酶啟動子Ppdc(1 534 bp)，經Pst I和Sal I雙酶切后插入到質粒pPHL得到重組質粒pPHL-Ppdc。以里氏木霉基因組DNA為模板，Tcbh1-F和Tcbh1-R(表1)為引物PCR擴增纖維二糖水解酶I終止子Tcbh1(702 bp)，經BamH I和EcoR I雙酶切后插入到質粒pPHL-Ppdc得到重組質粒pPHL-Ppdc-Tcbh1。將基因DsRed的mRNA輸入到Applied Biosystems Website設計siRNA靶序列，選擇其中兩條干擾片段命名為Red-T3和Red-T12，另選一條作為陰性對照，命名為DsRed-Neg。59-bp的siRNA干擾片段包含9-nt莖環結構，連接19-nt DsRed不同靶位點正向單鏈siRNA和19-nt反向單鏈siRNA，兩端各添加酶切位點Sal I和BamH I黏性末端對應的突出序列，由Life technologies公司合成siRNA寡核苷酸鏈(見表2)。成對寡核苷酸鏈利用PCR儀進行退火，反應程序:95℃加熱2 min，設置PCR儀使每秒下降0.1℃，降至25℃(約90 min)，結束后保存在4℃。這3個退火產物插入到經相同雙酶切后的載體pPHL-Ppdc-Tcbh1中，分別得到干擾載體pPHL-Ppdc-T3-Tcbh1、pPHL-Ppdc-T12-Tcbh1和pPHL-Ppdc-Neg-Tcbh1。

表1 構建重組質粒pPHL-Ppdc-Tcbh1使用的引物Table 1Primers amplified for phleomycin gene，Ppdc and Tcbh1

表2 基因DsRed的siRNA干擾片段Table 2Sequences of siRNA targeting on DsRed gene

1.2.2 真菌轉化和轉化子分析參考Penttil¨a等［17］的實驗方法，用聚乙二醇進行原生質體的制備與里氏木霉轉化。哈茨木霉的溶壁酶融于1 mol/mL MgSO4用于制備原生質體。轉化時，使用20 μg質粒DNA(pANRed1或pPpdc-shRNAs-Tcbh1)和200 μL PEG buffer。包含100 μg/mL潮霉素B(用于pAN-Red1)或100 μg/mL潮霉素B和250 μg/mL腐草霉素(用于pPpdc-shRNAs-Tcbh1)的PDA固體平板用于篩選轉化子，生長2～3 d。用牙簽挑取轉化子接種到新的篩選培養基上，并連續篩選培養觀察6代。提取轉化子的DNA經PCR鑒定確認shRNA表達盒子插入到轉化子的基因組中。

1.2.3 基因組DNA提取真空抽濾獲取液體培養的轉化子菌絲，用液氮研磨成干粉后凍于－80℃。參考Seiboth等［18］的方法提取基因組。利用RNA提取試劑盒按照說明書的方法從冷凍菌絲中提取總RNA。用DNase I處理RNA樣品以去除基因組DNA。用GeneQuant 1300分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的濃度和質量。

1.2.4 RNA反轉錄和熒光定量PCR使用反轉錄試劑盒RT-PCR kit，以oligo(dT)和隨機六聚體當引物，將約500 ng RNA反轉錄成cDNA。使用儀器進行熒光定量PCR。每個反應20 μL體積，包括2 μL模板(160稀釋反轉錄產物)，10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq，300 nmol/L正反向引物(見表1)和nuclease-free水。程序設置:預變性95℃30 s，95℃變性5 s和60℃退火延伸31 s，40個循環。結束后得到融解曲線，用以核對PCR產物的特異性。所有PCR反應每個樣品做3個復孔。結合ABI公司的軟件進行分析得到相應的標準曲線。基因DsRed的表達量通過內參基因肌動蛋白校正，以對照菌株的表達量為1，其他轉化子的表達量與對照樣品的比值作為數據分析。

1.2.5 DsRed熒光成像與測量使用奧林匹斯BX51TRF System觀察重組菌株的紅色熒光。紅色熒光在554 nm下被激發，用U-25ND6濾光器可檢測到紅色熒光。拍下熒光圖像，用軟件Image-Pro Plus 5.0分析紅色熒光的強弱。

1.2.6 SDS-PAGE電泳檢測和蛋白質印跡分析將菌株QM9414，DsRed-T.reesei菌株和干擾重組菌分別接種于PDA平板上，于28℃恒溫培養7 d后，用無菌水制備孢子懸液，取大約105個孢子接種到液體培養基上，28℃、250 r/min震蕩培養72 h。菌液真空抽濾后用液氮快速研磨成干粉，取約1 g干粉加入1 mL lysis buffer震蕩混勻3 min后4℃冰浴30 min，4℃、12 000 r/min離心5 min。吸取上清液轉移到新的1.5 mL EP管中，得到蛋白樣品。使用Bradford試劑，以牛血清蛋白(BSA)為標準品，測定蛋白樣品的濃度。每個蛋白樣品取60 mg進行SDS-PAGE電泳并轉膜到硝酸纖維素酶上。根據說明書使用DsRed單克隆抗體作為一抗進行免疫印跡，二抗使用羊抗鼠IgG-HRP，內參抗體使用Anti-alpha Tubulin。

1.2.7 數據分析每個樣品的檢測都做了3個復孔。使用單向方差分析實驗結果，從3個獨立的結果得到標準差(SD)，結果均表示為(均值±SD)。在所有的結果中，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 篩選穩定表達DsRed的重組菌株DsRed-T.reesei

本研究構建質粒pAN-Red1并轉化到T.reesei QM9414中，含有100 μg/mL潮霉素B的PDA固體平板篩選轉化子。為了獲得單克隆轉化子，洗脫孢子得到孢子懸液后接種到篩選平板上，連續接種培養至少8次，最后獲得重組菌株DsRed-T.reesei，并將其作為研究siRNA沉默的宿主菌。在熒光顯微下可觀察此菌株穩定表達強紅色熒光蛋白(圖1)。

圖1 質粒pAN-Red1轉入T.reesei QM9414獲得表達DsRed的重組菌株DsRed-T.reeseiFig.1T.reesei QM9414 transformed by plasmid pAN-Red1 generating recombinant DsRed-T.reesei strain重組菌株DsRed-T.reesei的菌絲分別在普通光源(A)和熒光光源(B)下的影像，(普通光源曝光時間:2 msec;熒光光源曝光時間:50 msecThe images of the mycelia of recombinant strain DsRed-T.reesei under ordinary light(A)and fluorescent light(B) respectively.Bars indicate 200 μm(exposed time under ordinary light:2 msec;exposed time under fluorescent light:50 msec)

2.2 RNAi下調DsRed的表達

本研究構建了重組質粒pPHL-Ppdc-T3-Tcbh1、pPHL-Ppdc-T12-Tcbh1和pPHL-Ppdc-Neg-Tcbh1，分別與質粒pAN7-1共轉入DsRed-T.reesei中得到38株里氏木霉干擾轉化子，具有潮霉素B和腐草霉素抗性。其中，23株T.reesei-DsRed-T3轉化子，15株T.reesei-DsRed-T12轉化子，另外作為對照獲得17株T.reesei-DsRed-Neg轉化子。將干擾轉化子接種到基本培養基培養3 d后用熒光顯微鏡觀察紅色熒光的情況。根據轉化子與對照菌株的熒光強度相比，將重組菌株分為3個等級，每個等級的個數占全部轉化子的比例如表3所示。數據顯示，干擾載體T.reesei-DsRed-T3的轉化子中干擾效果顯著的大約占87%，這是沉默效果最好的。T.reesei-DsRed-T12的轉化子中干擾效果顯著的大約為64%。然而，在DsRed-T3和DsRed-T12的轉化子中，29.4%和33.3%的抗性轉化子都顯示紅色熒光不同程度的減弱。熒光顯微鏡的觀察結果見圖2。圖像結果顯示，本研究構建的質粒pPHL-Ppdc-shRNA-Tcbh1中表達的shRNAs確實干擾和沉默了基因DsRed的表達，其中轉化子DsRed-T3-11、DsRed-T3-19、DsRed-T12-4和DsRed-T12-8的干擾效果較好。

表3 DsRed干擾轉化子的干擾效率Table 3Silenced DsRed Transformants of DsRed-T.reesei after transformation with shRNAs

圖2 重組菌株DsRed-T.reesei中的干擾效果Fig.2Silencing efficiency of DsRed by siRNAs in recombinant DsRed-T.reeseiW:第1列和第3列的菌絲影像為普通光源下拍攝;R:第2列和第4列的菌絲影像為熒光光源下拍攝W:First and third columns indicate image of the mycelia in bright field;R:Second and fourth columns indicate image of the mycelia in DsRed fluorescence

2.3 里氏木霉中DsRed開放閱讀框和shRNA干擾表達盒的完整性檢測

上述結果初步證明shRNA在T.reesei中能有效沉默DsRed。為排除熒光強度減弱是由里氏木霉的基因組損傷或DsRed表達盒不完整所致的可能性，需要進一步實驗確認，質粒pANRed1和pPHL-Ppdc-shRNAs-Tcbh1轉化DsRed-T.reesei經同源重組后，DsRed基因和siRNA表達盒的完整性。分別提取DsRed-T3-11、DsRed-T3-19、DsRed-T12-4、DsRed-T12-8和陰性對照DsRed-Neg-12與DsRed-Neg-24的基因組DNA作為模板，用引物(見表4)PCR分別擴增出DsRed開放閱讀框和shRNA干擾表達盒。結果顯示，6個樣品均能擴增出678 bp的DsRed編碼序列(圖3A)和754 bp的干擾表達盒子(圖3B)。

表4 用于檢測DsRed開放閱讀框和shRNA干擾表達盒的完整性的引物Table 4Primers used in analysis of the integrity of DsRed ORF and shRNA expression cassette

圖3 凝膠電泳分析重組菌的DsRed開放閱讀框和shRNA干擾表達盒Fig.3Electrophorestic analysis of DsRed ORF and shRNA expression cassette for recombinantA:DsRed開放閱讀框的PCR產物電泳;B:shRNA干擾表達盒的PCR產物電泳;M:DL2 000 bp DNA Marker;1～6:分別是重組菌株DsRed-T3-11、DsRed-T3-19、DsRed-T12-4、DsRed-T12-8、DsRed-Neg-12和DsRed-Neg-24A:Electrophoresis of amplified fragments of DsRed ORF;B:Electrophoresis of amplified fragments of the shRNA expression cassette;M:DL2 000 bp DNA Marker;1-6:The recombinant strains DsRed-T3-11，DsRed-T3-19，DsRed-T12-4，DsRed-T12-8，DsRed-Neg-12，DsRed-Neg-24

綜合上述結果表明，轉化后DsRed開放閱讀框和shRNA干擾表達盒完整，確認轉化子熒光強度的減弱來源于siRNA對靶基因DsRed的干擾，排除DsRed表達盒不完整或排除機體的衰減而導致熒光減弱的可能性。此外，還證明了siRNA干擾片段對里氏木霉DsRed的干擾作用發生在轉錄及轉錄后水平。

2.4 熒光定量PCR分析DsRed基因的表達量

為了進一步確認干擾重組菌中DsRed基因的下調情況，本研究進行QPCR檢測DsRed基因的mRNA表達水平。結果顯示，與原始菌株DsRed-T.ressei相比，干擾重組菌DsRed-T3-11、 DsRed-T3-19、DsRed-T12-4和DsRed-T12-8的DsRed基因表達水平都有不同程度的下降，分別是67.83%、99.89%、99.8%和100%。另外兩個干擾重組菌DsRed-Neg-12和DsRed-Neg-24并未顯示DsRed基因表達水平的下降(圖4)。

另外，為探究重組菌干擾效果的時間效應，選擇含有siRNA干擾片段T3的2個重組菌DsRed-T3-11和DsRed-T3-19，并以出發菌株DsRed-T.ressei為對照，進行QPCR檢測。如圖5所示，重組菌DsRed-T3-11在培養48、72和96 h時的DsRed相對表達量分別是各時段出發菌株DsRed-T.ressei表達量的33%、30%和32%，重組菌DsRed-T3-11的表達量則分別是出發菌株的0.2%、0%和0.01%。結果表明，同一株干擾重組菌在相同培養基中培養48、72和96 h時能均保持幾乎相同的干擾效果，說明干擾效果十分穩定。

圖4 重組菌在液體培養基中培養48 h后的DsRed基因相對表達量Fig.4Q-RT-PCR detection of mRNA expression level of DsRed in recombinant after incubation for 48 h出發菌株的DsRed基因相對表達量，設為1。誤差棒代表標準差(珚X±SD，n=3，*P＜0.05，＊＊P＜0.01)，圖5同Error bars represent standard deviations(珚X±SD，n=3，*P＜0.05，＊＊P＜0.01)，same figure 5

圖5 重組菌DsRed-T3-11和DsRed-T3-19培養48、72和96 h的DsRed基因相對表達量Fig.5Q-RT-PCR detection of mRNA expression level of DsRed gene in tansformants after incubation for 48，72 and 96 h respectively

2.5 干擾重組菌的蛋白質印跡分析

為了確認干擾重組菌中mRNA表達水平和蛋白合成水平一致，本研究進行了蛋白質印跡。從原始菌株T.reesei QM9414、菌株DsRed-T.reesei、干擾重組菌DsRed-neg-12和DsRed-T3-19中提取蛋白樣品。結果如圖6所示，菌株DsRed-T.reesei和DsRed-neg-12樣品顯示了明顯的蛋白條帶，而菌株T.reesei 9414和干擾重組菌DsRed-T3-19并未顯示蛋白條帶。綜合這些結果表明，蛋白質印跡結果與QPCR檢測結果完全一致。

圖6 重組菌DsRed-T3-19和對照組的蛋白質印跡分析Fig.6Western bolt assay of transformant s and controls for 72 h respectivelyT.reesei QM9414:原始菌株;DsRed-T.reesei:能穩定表達DsRed的重組菌株;DsRed-neg-12:轉入陰性對照片段的重組菌株;DsRed-T3-19:轉入有效干擾片段的重組菌株;以上菌株均在液體培養72 hT.reesei QM9414:Host cell;DsRed-T.reesei:The transformant with expression of DsRed;DsRed-neg-12:The transformant with negative sIRNA;DsRed-T3-19:The transformant with effective sIRNA;Both strains are cultured for 72 h

3 討論

RNA干擾體系已在不同的生物中建立發展起來，多用綠色熒光蛋白(GFP)作為報告基因，便于使用熒光顯微鏡從平板上篩選轉化子［19-20］。GFP已成功用于各種微生物中［21-23］，宿主細胞攜帶一個gfp基因并在熒光顯微鏡下發出綠色熒光。然而，原始菌株康氏木霉在GFP的波長上顯示出一定程度的內源性熒光，在篩選過程中會出現假陽性轉化子［9］。在子囊真菌如覃青霉、綠木霉和哈茨木霉中，紅色熒光蛋白已成功表達，并在頂頭孢霉中作為報告基因進行RNA干擾［9，24-25］。但與里氏木霉相關的研究從未報道。Wang等［9］以DsRed為報告基因，建立一個有效的RNA干擾體系，在工業生產菌株康氏木霉中能維持穩定的干擾效果。盡管能有效地沉默靶基因，但由于表達shRNAs的質粒太大難以構建，難以同時沉默多個靶基因。本研究構建了質粒pPHL-Ppdc-shRNA-Tcbh1并轉化到菌株DsRed-T.reesei中，此菌株是轉入質粒pAN-Red1的重組菌株，由丙酮酸激酶基因的啟動子pkil和cbh2終止子調控DsRed基因表達。另外，質粒pPHL-Ppdc-shRNATcbh1中的siRNA表達盒是由pPdc啟動子和cbh1終止子調控表達。結果表明，DsRed的開放閱讀框和siRNA表達盒都能通過PCR成功擴增，意味著DsRed基因和siRNA表達盒都完整地同源重組到菌株的基因組上。本研究構建了包含shRNA、Ppdc啟動子和cbh1終止子的重組質粒。這個質粒比報道過的絲狀真菌發夾RNA表達質粒更有效［25-27］。

在熒光顯微鏡上能清楚觀察到菌絲發出紅色熒光，相比對照組，紅色熒光在篩選真菌干擾轉化子時起到重要的標記作用(見圖2)。結果表明，重組質粒pPHL-Ppdc-shRNA-Tcbh1所表達的shRNA能有效干擾靶基因的表達，報告基因DsRed為篩選干擾轉化子起到至關重要的作用。本研究結果顯示，干擾效率在DsRed-T3的轉化子中高達86.96%，在DsRed-T12中為68.42%。干擾效果的不同可能有以下幾個原因:第一，目標片段的位置不同。第二，轉化子中可能發生非同源重組。Hoff等［28-30］發現在青霉菌中常常發生非同源重組，所以會產生不同的基因敲除菌株。第三，轉化子中可能發生不同拷貝數的同源重組。Young等［31-32］發現質粒pAN7-1插入到單一位點上，卻出現4～6個從頭到尾串聯排列的拷貝數。第四，絲狀真菌中RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)對序列特異性的siRNAs的合成和擴增十分重要，為生物提供了源源不斷的siRNA。此擴增數量的不同可能會導致基因沉默的效果不同［33-35］。利用粗糙脈孢菌qde-1基因產物為查詢序列對T.reesei基因組進行blast，結果發現一個氨基酸同源性高達55%的RdRP。

不管是在真菌中還是在其他生物體系中，RAN干擾的高效率和序列特異性，報告基因DsRed的操作方便性和蛋白質組學與微陣列分析的不斷改進，都極大促進了新型高通量手段的發展［36-38］。T.reesei中DsRed基因的高效沉默，加上高通量表達的篩選方式，有望加速我們對真菌生理過程的理解，有利于實現更多針對性的遺傳操作以及對當前和未來工業利用真菌的持續優化。我們的數據清晰地表明，上述用于T.reesei的RNA沉默方法是有效的，DsRed基因相比于對照菌株通過發出紅色熒光為篩選沉默轉化子提供了更為方便的手段。這個體系在T.reesei中可能產生多重敲除的重組菌株，能研究涉及共同生物合成途徑的多個基因的功能，并且能用于同時沉默多個靶基因。最近為了構建真菌RNAi的發夾載體文庫，Gateway(Invitrogen)的體外重組技術用于高通量克隆［1］。本研究所改進的方法能用于構建包含siRNAs的載體繼而沉默涉及代謝途徑的多個靶基因，因此能同時沉默多個靶基因。為了能有效地同時沉默多個靶基因，短發夾RNA (shRNA)應篩選后插入到載體上。

本研究結果表明，重組載體表達的siRNA在菌株DsRed-T.reesei中能有效沉默DsRed基因，報告基因DsRed為篩選干擾重組菌提供了方便的手段。本文所述的研究方法可用于通過調控控制蛋白的表達研究同源或異源表達情況。

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ShRNAs Silencing DsRed Gene in the Filamentous Fungus Trichoderma reesei

LI Jie-xuan1，LIU Wen-li1，LIANG Zhi-cheng2，WANG Shao-wen2，LIANG Xiu-yi1，SHE Wei-yi1，LIU Gang1，TIAN Sheng-li1
(1.Coll.of Life Sci.＆Oceanol.，Shenzhen Municip.Key Lab.of Micro-Genetic Engin.，2.Shenzhen Municip.Key Lab.of Oceano-Ecol.＆Bio-Res.，Shenzhen Uni.，Shenzhen 518060)

The establishment of a red fluorescent protein(DsRed)in Trichoderma reesei as a reporter gene of RNA interference method is reported in this paper.Firstly，a plasmid pANRed1 that expressed DsRed was constructed to transform T.reesei QM9414，and obtained a strain of DsRed-T.reesei that resist against hygromycin and could steadily express DsRed.Secondly，pyruvate decarboxylase promoter and the cellobiohydrolase I terminator cbh I as original parts was cloned into vector pPHL，and constructed pPHL-Ppdc-Tcbh1 plasmid.According to the sequence of DsRed gene，a specific siRNA interference sequence and another siRNA with nonhomogenous sequence siRNA as negative control，were cloned into vector pPHL-Ppdc-Tcbh1 and obtained recombinant plasmid.Transform it into DsRed-T.reesei，and screened transformant on PDA plate containing 100 μg/mL of hygromycin and 250 μg/mL of phleomycin.The results showed that approximately 79%of transformant appeared red fluorescence silence phenomenon，among them some transformant DsRed’s expressed almost total inhibition.Fluorescence quantitative PCR and Western blotting analysis showed that DsRed gene expression was down regulated to different degrees.The above results suggested that the study on gene expression in T.reesei could be regulated with this method.

Q78

A

1005－7021(2016)04－0007－09

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.002

國家自然科學基金項目(31070044);深圳市科技基礎研究發展計劃項目(ZYC201105130092A)

李潔璇女，碩士研究生。研究方向為基因表達與調控。E-mail:195378637@qq.com

劉雯莉女，碩士研究生。研究方向為基因表達與調控。E-mail:235410806@qq.com。李潔璇與劉雯莉為并列第一作者。

*通訊作者。男，教授，博士，碩士生導師。研究方向為基因表達與調控。E-mail:sltian@szu.edu.cn

2015-10-27;

2016-01-12