鄧振山,馬亞茹,何園,李超,汪飛,賀曉龍,趙瑞華
(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安716000;2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子832003; 3.延安市微生物研究所,陜西延安716000)
蘋果樹內(nèi)生菌篩選及其對蘋果腐爛病防治效果
鄧振山1,馬亞茹2,何園2,李超2,汪飛3,賀曉龍1,趙瑞華1
(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安716000;2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子832003; 3.延安市微生物研究所,陜西延安716000)
為了獲得蘋果腐爛病菌的內(nèi)生拮抗菌株,并初步研究其拮抗特性以及防治效果,用平板對峙法從蘋果樹根部、莖部、葉片篩選到具有拮抗作用的內(nèi)生菌,明確其無菌濾液的抑菌效果,并測定拮抗菌株對蘋果離體果實(shí)腐爛病害的防治效果。從分離純化的56株內(nèi)生菌中篩選出12株蘋果腐爛病菌的拮抗菌,其中G2、G9、J32和Y40的抑菌效果比較明顯,分別為69.64%、58.93%、67.86%、67.88%,當(dāng)G2和G9的無菌濾液濃度達(dá)到8%時,其抑制率最高,分別達(dá)到了78.26%、76.29%,J32和Y40的無菌濾液濃度達(dá)到8%時抑制率均達(dá)到72.33%;在蘋果果實(shí)離體試驗(yàn)中,G2、Y40的抑制率分別達(dá)到32.56%和26.89%;所篩選的這4株菌株對小麥赤霉病菌(FusaHum graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、煙草赤星病菌(Alternaria longipes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)均有一定的抑制作用,其中抑制率最高達(dá)79.65%;4株菌對蘋果腐爛病病原菌的抑制大多數(shù)會導(dǎo)致病原菌菌絲畸形。試驗(yàn)結(jié)果表明拮抗真菌G2、G9、J32和Y40均對蘋果腐爛病菌有較強(qiáng)拮抗作用,為進(jìn)一步開展蘋果主要病害的生物防治研究提供了潛在資源菌。
蘋果樹;內(nèi)生菌;蘋果腐爛病;拮抗菌株;生物防治
植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部的真菌、細(xì)菌和放線菌,屬于植物組織內(nèi)的正常菌種[1]。植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中,與植物形成了互惠互利的關(guān)系。植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生活性物質(zhì),可作為生物防治資源及新藥的來源[2]。植物內(nèi)生菌以其占據(jù)有利的生態(tài)地位,不易受環(huán)境條件的影響,能夠很好地定殖于植物的相應(yīng)部位,抵抗病原物入侵等獨(dú)有的優(yōu)勢,成為植物病害生物防治的潛在資源菌[3],并顯示出巨大的應(yīng)用前景。生物農(nóng)藥無毒、無害、無污染,不易產(chǎn)生抗藥性,保持生態(tài)平衡,成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。蘋果腐爛病(Valsa mali Miyabe et Yamada),俗稱爛皮病、臭皮病,是由黑腐皮殼屬(Valsa ceratosperma,無性型為殼囊孢屬Cytospora)真菌引起的一種重要病害,是我國北方蘋果樹重要病害。主要危害6年以上的蘋果樹,造成樹勢衰弱、枝干枯死、死樹,甚至毀園。中國蘋果腐爛病的防治主要依靠農(nóng)業(yè)防治和噴施化學(xué)殺菌劑,長期使用化學(xué)殺菌劑帶來了病原菌抗藥性、環(huán)境污染和果品農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問題。隨著社會對環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注及對綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品需求的日益迫切,利用拮抗微生物防治植物病害作為綠色環(huán)保、長效的防治途徑已經(jīng)被推到了病害防治的前沿[4]。植物內(nèi)生真菌能促進(jìn)寄主植物生長,增強(qiáng)其抗病能力,并通過與病原菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和空間來抑制病原菌的生長,以及產(chǎn)生一些抗生素類和水解酶類等物質(zhì)對病原菌的正常生長產(chǎn)生影響,最終導(dǎo)致其死亡。目前,國內(nèi)關(guān)于蘋果腐爛病生物防治的研究較多[5],且大多僅針對其中一種病原菌進(jìn)行拮抗菌株的篩選和研究。利用植物內(nèi)生菌防治蘋果腐爛病已有一些報道,郜左鵬等[6]研究了內(nèi)生放線菌對蘋果腐爛病的防治,鄧振山等[7]研究了銀杏內(nèi)生真菌對蘋果腐爛病的抑制作用,徐濤等[8]研究了健康蘋果樹皮內(nèi)生真菌對蘋果腐爛病的防治效果。但從健康蘋果樹各個組織進(jìn)行篩選,分離出各類型拮抗菌株的研究較少。本文從健康蘋果樹各個部位篩選,獲得了拮抗內(nèi)生菌株,利用這些菌株進(jìn)行蘋果腐爛病生物防治,更廣泛地為蘋果腐爛病篩選高效菌株,并初步探索其無菌濾液對蘋果腐爛病病原菌菌絲生長的的抑制作用,為研究蘋果腐爛病的生物防治提供潛在的資源菌。
1.1 材料
1.1.1 樣品采集供試蘋果樹根部、莖部和葉片于2012年5月自延安市寶塔區(qū)棗園鄉(xiāng)廟溝村8年生的“富士”品種蘋果園采集,將從健康樹采集到的樣品放入采集袋做好標(biāo)記并立即帶回實(shí)驗(yàn)室,儲存于4℃冰箱內(nèi),及時進(jìn)行內(nèi)生菌分離。
1.1.2 供試植物病原菌蘋果腐爛病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、小麥赤霉病菌(FusaHum graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、玉米彎孢病菌(Curvularia lunata)、玉米大斑病菌(Helminthosporium turci cum Pass)、煙草赤星病菌(Alternaria longipes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)、蘋果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)和西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。
1.1.3 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,高氏一號培養(yǎng)基。
1.2.1 蘋果樹內(nèi)生菌的分離純化用無菌水浸泡蘋果樹莖部、根部和葉部3~5 h,用95%的乙醇浸泡2 min后,無菌水沖洗3次,再用0.1%的氯化汞表面消毒30 s,無菌水漂洗5次,將最后一次沖洗液作為對照涂布于平板以檢測表面消毒是否徹底[9]。取消毒的蘋果樹各組織,用剪刀將葉片剪成0.5 cm2大小,將莖部、根部剪成0.25 cm長,將剪下的組織塊分別接到PDA培養(yǎng)基平板上,每個平板接4個組織塊,28℃培養(yǎng)72 h,待周圍長出菌落后,按照菌落形態(tài)、大小、顏色等不同的特征進(jìn)行初步分離純化[10],得到純化菌株后,接至斜面置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 蘋果樹內(nèi)生菌對蘋果腐爛病的抑菌試驗(yàn)
采用平板對峙法[11],測定經(jīng)過分離純化后的內(nèi)生菌對蘋果腐爛病病原菌的抑菌活性。將活化后的蘋果腐爛病病原菌菌落用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅,置于PDA平板中央,用同樣的方法在距其2 cm處接種已經(jīng)分離純化的內(nèi)生菌,每個平板接4個菌餅,在28℃下培養(yǎng);以只接種蘋果腐爛病病原菌的平板為對照,每處理3次重復(fù)。待對照平板上長滿菌絲時,測量菌落直徑,計(jì)算菌落生長抑制率。
菌株生長抑制率(%)=((對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑)×100%
1.2.3 拮抗菌無菌濾液對蘋果腐爛病菌菌絲生長的影響①拮抗菌無菌濾液的制備:將4℃保存的菌株轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中活化3次,將拮抗菌菌株按10%的接種量接種到PDA液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL/300 mL三角瓶),28℃、180 r/min培養(yǎng)4 d,分別將其培養(yǎng)液裝入50 mL的離心管,用低溫高速冷凍離心機(jī)(4℃,10 min,6 000 r/min)離心3次,每次取其上清液,然后用一次性針孔式微孔濾器(0.22 μm,50 mm,水系,混合纖維)過濾,即得到該菌的無菌濾液[12-13],4℃保存?zhèn)溆谩"谵卓咕鸁o菌濾液對蘋果腐爛病病原菌菌絲的抑制率測定:取已制備的無菌濾液,置于定量的PDA(45℃)培養(yǎng)基中,使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到2%、4%、6%、8%、10%,然后將培養(yǎng)基置于滅菌的培養(yǎng)皿(9 cm)中,待培養(yǎng)基凝固后在平板中央接種6 mm的蘋果腐爛病病原菌菌餅,以加無菌水的PDA培養(yǎng)基處理作為空白對照,每次處理3次重復(fù),28℃恒溫培養(yǎng)72 h后,用十字交叉法測量蘋果腐爛病病菌的直徑,計(jì)算抑制率(公式同上)。
1.2.4 離體果實(shí)試驗(yàn)摘取大小、成熟度一致的蘋果,在果實(shí)的兩側(cè)用消毒刀片分別切除一小塊,編為1號、2號,1號接20 μL清水為對照,2號接20 μL拮抗菌無菌濾液,保鮮膜封口,將果實(shí)于20℃黑暗條件下培養(yǎng),1 d后將一塊直徑為6 mm蘋果腐爛病病原菌菌餅接種于切口內(nèi),然后重新用新的保鮮膜封口,置于黑暗條件下培養(yǎng)5 d后測量對照組和處理組的病斑直徑,每個處理3次重復(fù),根據(jù)病斑直徑計(jì)算拮抗菌株的抑制率[14]。
拮抗菌株的抑制率(%)=((對照組病斑直徑-處理組病斑直徑)/對照組病斑直徑)×100%
1.2.5 抗菌譜試驗(yàn)為探究所篩選內(nèi)生菌針對其他指示菌的拮抗性能,采用平板對峙法,測定經(jīng)平板對峙實(shí)驗(yàn)篩選的具有明顯拮抗作用的內(nèi)生菌抗性菌譜,供試病原菌為除蘋果腐爛病病原菌之外的10種指示菌,將病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基中央,28℃培養(yǎng),待菌絲長滿培養(yǎng)皿,用打孔器在菌落邊緣制成菌餅,將其置于另一PDA平板中央,并距菌餅約2 cm處用同樣方法接種所篩選的內(nèi)生菌,28℃培養(yǎng);以只接10種指示菌的平板為對照,每次處理3次重復(fù),待對照平板長滿菌絲,測量菌落直徑,計(jì)算菌落生長抑制率。10株植物病原菌分別為小麥赤霉病菌(FusaHum graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、煙草赤星病菌(Alternaria longipes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、玉米彎孢病菌(Curvularia lunata)、玉米大斑病菌(Helminthosporium turcicum Pass)和蘋果炭疽病菌(Glomerella cingulata),編號為1~10。
無節(jié)幼體階段依靠自身體內(nèi)卵黃做營養(yǎng),無須投喂餌料。在這一階段,水溫控制在20~22℃,PH保持在7.8~8.6,無節(jié)幼體期水質(zhì)比較清凈,幼體耗氧量低,微充氣即可。無節(jié)幼體期歷時約4d,經(jīng)過6次蛻皮變態(tài)為蚤狀幼體。無節(jié)幼體培育期間每天加水15~20cm。
1.2.6 拮抗菌株對蘋果腐爛病病原菌的抑制作用將篩選到的拮抗菌和病原菌分別接入平板內(nèi)進(jìn)行平板對峙試驗(yàn),5 d后觀察有無抑制圈,當(dāng)拮抗菌株對蘋果腐爛病病原菌有抑菌圈時,從拮抗菌株與病原菌的抑菌帶中挑取菌絲,制成裝片,在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)有無變化[15],并拍照記錄。
1.2.7 數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和IBM SPSS Statistic 19進(jìn)行試驗(yàn)分析。
2.1 蘋果樹內(nèi)生菌的分離和篩選
從蘋果樹莖部、根部、葉片中分離的56株菌株中,篩選12株有一定抑菌活性的內(nèi)生菌(表1),其中菌株G2、G9、J32和Y40對蘋果腐爛病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,均達(dá)到了55.0%以上,菌株G2的抑菌活性最強(qiáng),其抑制率為69.64%。通過形態(tài)學(xué)對這4種內(nèi)生菌進(jìn)行初步鑒定,其中G9、J32和Y40分屬于鏈格孢屬(Alternaria sp.)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma sp.)和球殼孢屬(Sphaeropsis sp.),菌株G2歸屬于諾卡氏放線菌(Nocardia),見表2。

表1 蘋果拮抗內(nèi)生菌對蘋果腐爛病菌菌絲生長的抑制作用Table 1Inhibitory effects of antagonistic fungus on mycelial growth of V.ceratosperma

表2 G2、G9、J32和Y40的分類結(jié)果Table 2The identification of strains G2,G9,J32 and Y40
2.2 拮抗菌無菌濾液對蘋果腐爛病菌菌絲生長的影響結(jié)果
由表3可以看出,拮抗菌無菌濾液對病原菌菌絲生長有一定的抑制作用,在一定范圍內(nèi),隨無菌濾液濃度的增加菌落直徑減小,而菌絲生長的抑制率相應(yīng)提高。當(dāng)G2菌株培養(yǎng)基的無菌濾液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時抑制效果最好,病原菌菌絲生長明顯受到抑制,抑制率達(dá)到78.26%;G9的無菌濾液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時,其抑制率最高,達(dá)到76.29%;Y40、J32的無菌濾液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時抑制效果最好,抑制率均為72.33%(表3)。

表3 無菌濾液對病原菌菌絲生長的抑制效果Table 3Effectof cell free fermented filtration on mycelial growth of pathogen
2.3 離體果實(shí)試驗(yàn)結(jié)果
果實(shí)離體試驗(yàn)結(jié)果表明,4株拮抗菌無菌濾液對蘋果腐爛病病原菌具有明顯的抑制作用,其中G2和Y40的抑制率較高,分別為32.56%和26.89%,G9和J32的抑制率分別達(dá)24.34%和22.64%,見表4。

表4 拮抗菌株無菌濾液對蘋果腐爛病病原菌的離體果實(shí)試驗(yàn)Table 4Control efficacy of the antibiotic cell free fermented filtration against V.ceratosperma on isolated fruit
2.4 抗菌譜試驗(yàn)
測定G2、G9、J32、Y40對除蘋果腐爛病病原菌外的10株病原菌的抑制能力,繪制出抗性菌譜。對10種常見植物病原真菌的抑菌活性測定結(jié)果表明,拮抗菌株G9、J32、Y40對10株病原菌中的7株植物病原菌(1~7號)均具有明顯的抑制作用,但對其中的3種病原菌(8~10號)抑制效果不明顯;菌株G2對10株菌都有抑制作用,其中對小麥赤霉病菌的抑制率最高,達(dá)到79.65%;菌株G9、J32、Y40對小麥赤霉病菌的抑制率最高,分別為67.83%、55.81%和51.16%,見圖1。

圖1 拮抗菌株對7種常見病原真菌的抑菌活性Fig.1Inhibition activities of antagonistic strains against seven common pathogenic fungi
2.5 拮抗菌株對蘋果腐爛病病原菌的抑制作用
試驗(yàn)表明,G2、G9、J32、Y40均出現(xiàn)抑制圈,用顯微鏡觀察裝片的菌絲,發(fā)現(xiàn)菌絲的形態(tài)有明顯變化(表5),G2、G9、J32、Y40的抑制使病原菌菌絲發(fā)生不同變化(圖2)。

表5 4株拮抗菌對蘋果腐爛病病原菌的抑制作用Table 5Inhibitory effect of antagonistic bacteria on the mycelia growth of V.ceratosperma

圖2 蘋果腐爛病病原菌的菌絲形態(tài)Fig.2Morphology of V.ceratosperma normal myceliaA:受拮抗蘋果腐爛病病原菌畸形和斷裂菌絲;B:正常蘋果腐爛病病原菌菌絲A:Malformation and cracked mycelium of V.ceratosperma were antagonized;B:The normal mycelia of V.ceratosperma
本研究自健康蘋果樹的根部、莖部、葉片組織中分離篩選了4株內(nèi)生菌G2、G9、J32、Y40,研究了其無菌濾液對蘋果腐爛病病原菌的抑制效果,以及對離體果實(shí)的防治效果。結(jié)果表明,所分離的內(nèi)生菌對蘋果腐爛病病原菌有較強(qiáng)的抑制作用及生物防治能力,抗性菌譜的試驗(yàn)表明,這些內(nèi)生菌不僅對蘋果腐爛病病原菌有抑制作用,而且對其他植物病原菌有一定的抑制作用,如小麥赤霉病菌(FusaHum graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、煙草赤星病菌(Alternaria longipes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum),表明從健康植物體內(nèi)篩選內(nèi)生菌對植物病蟲害的防治有效,同時也為生物農(nóng)藥的制備提供了依據(jù)。
本研究篩選得到的4株拮抗菌中,G2的抑制率最高,G9、J32的抑制率次之,Y40的抑制率最低。拮抗菌株的無菌濾液對蘋果腐爛病病原菌的抑制效果較好,說明有某種活性物質(zhì)使菌株有拮抗性能[16],結(jié)合蘋果離體試驗(yàn)結(jié)果可知,拮抗菌對蘋果腐爛病的離體果實(shí)試驗(yàn)效果不夠明顯,這可能與培養(yǎng)時間長短有關(guān),也可能是由于拮抗菌對環(huán)境的適應(yīng)性差。大量研究證明拮抗菌產(chǎn)生抑制的作用機(jī)制有很多,主要有競爭、拮抗、溶菌、誘導(dǎo)植物抗病和促進(jìn)植物生長等幾個方面[17],本研究篩選到的拮抗菌對蘋果腐爛病病原菌均有很好的防效,抑制機(jī)制多為拮抗、溶菌等,使病原菌菌絲發(fā)生斷裂、畸形、萎縮。在蘋果果實(shí)離體條件下,由拮抗菌產(chǎn)生的具有拮抗活性的次生代謝產(chǎn)物是拮抗菌發(fā)揮抑制性能的主要作用機(jī)制[18-20]。
內(nèi)生菌研究的巨大潛力體現(xiàn)在內(nèi)生菌對植物病害防治上,但就近年來使用情況看,在農(nóng)作物生產(chǎn)中應(yīng)用植物內(nèi)生菌防治病害時還存在一些問題,如大多數(shù)拮抗細(xì)菌的篩選及其防治性能測定僅在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,與室外運(yùn)用在各方面都有較大差別,因?yàn)橹参飪?nèi)生菌本身是一個生物活體,田間環(huán)境和植物體微生態(tài)環(huán)境中許多因子都會影響內(nèi)生菌防病作用的發(fā)揮,因此,有關(guān)拮抗菌的有效作用成分、抑菌機(jī)理、在田間的適應(yīng)能力、穩(wěn)定性以及田間防治效果等,尚有待進(jìn)一步深入研究[21-22]。
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Screening Endophytic Bacteria Strains of Anti-Apple Tree Decay (Valsa ceratosperma)from Apple Trees and Their Control Effect
DENG Zhen-shan1,MA Ya-ru2,HE Yuan2,LI Chao2,WANG Fei3,HE Xiao-long1,ZHAO Rui-hua1
(1.Coll.of Life Sci.,Yan’an Uni.,Yan’an,716000;2.Coll.of Life Sci.,Shihezi Uni.,Shihezi 832003; 3.Yan’an Inst.of Microbiol.,Yan’an 716000)
Endophytic antagonistic bacterial strains against apple tree decay(Valsa ceratosperma,Vc)were screened to explore their inhibitory and bio-control effects initially.Endophytic bacteria were isolated from the apple trees with the antagonism experiment by confrontation culturing on PDA media.Under condition in vitro of apple fruits,their prevention and control effect to Vc were measured.Moreover,the endophytic antagonistic bacteria were measured to antagonistic effect by using confrontation culturing.The results indicated that four strains of them(G2,G9,J32,Y40) have a striking inhibitory effect,the antagonistic effect of G2,G9,J32 and Y40 to Vc were 69.64%,58.93%,67.86%,and 67.88%.respectively.The antagonistic effect of G2,G9,J32 and Y40 to Vc were obvious,the highest inhibitory rate up to 78.26%,76.29%,72.33%,and 72.33%at the filtrate concentration 8%respectively.The highest inhibitory rate of the fruit in vitro reached 32.56%and 26.89%respectively.The antimicrobial spectrum test showed that four strains expressed antibiotic activity on Fusarium oxysporum f.sp.niveum,Curvularia lunata,Al-ternaria longipes,F(xiàn).graminearum,Glomerella cingulata,Pyricularia oryzae Cav.,F(xiàn).oxysporun f.sp.vasinfectum,the highest inhibition rate up to 79.65%.At the same time,they exhibited inhibition activities against V.ceratosperma,their hyphae were deformative under microscope.Therefore,endophytic bacteria G2,G9,J32,and Y40 have a striking inhibitory effect against V.ceratosperma.They were considered as potential fungal resource for further study on V.ceratosperma.
apple tree;endophytes bacteria;antagonistic bacteria;Valsa ceratosperma;bio-control
Q939.95
A
1005-7021(2016)04-0016-06
10.3969/j.issn.1005-7021.2016.04.003
延安市科技局重大專項(xiàng)(2014CGZH-06);陜西省科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2014HM-14);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2012KTZB03-02-03,2012CGX7,2016TTC-N-3-1)
鄧振山男,副教授,博士。主要從事植物病害綜合防治和環(huán)境微生物研究。E-mail:zhenshandeng214@163.com
2015-06-19;
2015-09-09