對水葫蘆有殺草活性的菌株S63的分離篩選

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源從水葫蘆病株及其水體中分離和純化獲得的菌株。

1.1.2 培養基水葫蘆瓊脂:水葫蘆莖40 g，加少許水磨碎取汁，瓊脂20 g，用自來水定容到1 000 mL;PDA培養基:馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，瓊脂2 g，蒸餾水1 000 mL;氨氮平板培養基［11］:檸檬酸三鈉3 g，NH4H2PO40.4 g，KH2PO41 g，NaCl 3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4;發酵培養基:蛋白胨0.5 g，酵母膏1.5 g，葡萄糖5 g，K2HPO40.1 g，NaCl 1.5 g自來水1 000 mL，pH 7.2;水葫蘆培養液:采用Hoagland溶液配方［12］;以上培養基均在121℃滅菌30 min，含有葡萄糖的培養基，應將葡萄糖單獨在115℃滅菌15 min后再加入培養基中。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離取水葫蘆病株的葉片，用次氯酸溶液擦洗，無菌水沖洗3遍，研磨，取汁，涂布于水葫蘆瓊脂平板培養基上。從水葫蘆病株所處的水體中，取1 mL水樣涂布在水葫蘆瓊脂平板培養基上，28℃培養箱培養2～4 d。挑取單菌落，并進行菌株純化，將純化后的菌株，保存在PDA斜面。將純化菌株接種于氨氮平板上，28℃培養2～4 d，挑取保存產生透明圈的菌株。取正常生長的水葫蘆植株，用70%酒精反復擦洗其莖部表面，無菌水沖洗數次，剪取約5 cm長的小段，置于墊有無菌濾紙的培養皿中，加入少許無菌水，以保持一定的濕度，將初篩獲得的純化菌株接種于水葫蘆莖處，置室溫培養，選取能致水葫蘆莖部出現黑斑的菌株。將上述篩選獲得的菌株接入發酵培養基中，28℃培養2～4 d，吸取菌液按0.5%、1%、2%(體積分數)比例加入到水葫蘆生長液中，取正常生長的水葫蘆植株移栽于上述培養液中，以不添加菌液為對照，每組作3個重復。于25℃光照培養箱中培養15 d，選取可抑制水葫蘆生長的菌株為復篩菌株。

1.2.2 菌株鑒定將培養3 d的菌株接種于40 mL LB培養液的三角瓶(100 mL)，于35℃、160 r/min恒溫振蕩培養48 h后制成菌懸液，離心收集菌體，采用CTAB/NaCl法提取菌株基因組DNA。通過利用細菌測序的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對前期提取的DNA進行PCR擴增。擴增后的DNA產物送上海生工生物有限公司進行純化測序，測序結果與GenBank中的序列進行blast比對。

1.2.3 水葫蘆自然生態培養模擬實驗將生長正常的水葫蘆植株10株移栽于8 L添加2%(體積分數)菌液的生長培養液中，同時以不添加菌液作為空白對照，均設3組重復，露天培養，觀察和記錄水葫蘆生長情況。以葉片染病情況計算發病率。水葫蘆病情分級標準［12］:0級，葉片上無任何病斑;1級，葉片上少數病斑，總面積小于三分之一;2級，葉片上病斑總面積大于三分之一，小于三分之二;3級，葉片上病斑面積大于三分之二;4級，葉片全部枯萎。水葫蘆葉片的發病率和病情指數分別按以下公式計算:發病率(100%) =染病葉片數/總葉片數×100;葉片病情指數=(Σ(發病級別×該級的葉片數)/(總葉片數×4))×100%。

1.2.4 酶的分析丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測定方法，參見鄒奇編寫的方法［13］。過氧化物酶(POD)活性測定:采用李合生的愈創木酚比色法［14］。

1.2.5 菌株對富營養化水體的凈化試驗取富營養化水樣1 000 mL，按110 000的體積比例接入S63的菌液，以不添加菌液為空白對照組，均設立3個平行組，室溫間歇曝氣(即曝氣12 h，靜止不曝氣12 h)，不同時間段取樣測定水體中氨氮和化學需氧量(COD)的濃度。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從水葫蘆病株和其生長水體中分離到139株可以在水葫蘆瓊脂平板上生長的菌株，將這些菌株分別在氨氮平板上點種，于28℃培養，挑取平板上呈現透明圈的菌株作為初篩菌株。再將這些菌株在水葫蘆莖上點種，室溫培養3～4 d后，在水葫蘆莖上出現黑斑的菌株有36株。

將上述獲得的36株菌接入發酵培養基中，28℃培養2～4 d，取培養液分別按0.5%、1%、2% (體積分數)比例加入到水葫蘆生長液中，將水葫蘆植株置于光照培養箱中25℃光照培養15 d，觀察水葫蘆生長狀況，其中有6株菌(S29、S39、S44、S57、S60、S63)的菌液在加入后第5天使水葫蘆的生長受到抑制，至第15天植株均枯黃衰萎。選取較早出現抑制現象、抑制效果比較穩定的S63菌株作為后續擴大培養的實驗菌株。

2.2 菌株鑒定

將菌株S63進行菌種鑒定，先提取菌株總DNA，再進行16S rRNA序列擴增和序列測定，通過BLAST軟件與NCBI網站中的GenBank數據庫的16S rRNA進行比對，結果表明，其大小為1 393 bp，與Pseudomonas protegens strain Azi15的同源性最高，相似性達99%，S63屬于假單胞菌屬。該菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露醇、甘油、檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、肌醇，不利用蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、酒石酸甲鈉、草酸鈉，不水解纖維素，能液化明膠，胨化牛奶，石蕊牛奶還原褪色，不產硫化氫。

2.3 菌株S63在水葫蘆露天培養中的抑制作用

在水葫蘆培養液中按2%(體積分數)的比例加入菌液，經過11批次15 d的露天培養實驗，試驗組的發病率為41.2%～100%，病情指數為30.9%～96.4%，對照組發病率19.4%～33.3%，病情指數為7.4%～20.2%，見表1、圖1所示。

表1 水葫蘆加菌液試驗組和對照組在露天培養的發病狀況比較Table 1Comparision of the disease condition between the test group and control group during the outdoor cultivation

續表1

圖1 露天培養水葫蘆Fig.1Outdoor cultivation of water hyacinth

2.4 酶活性的測定

植物在逆境條件下會發生應激反應，從而引起一系列生理生化變化。病原菌或植物毒素入侵后，植物體內有大量活性氧迅速產生，高濃度的活性氧將危害植物自身細胞，因此植物體內存在清除活性氧的防御酶系，例如SOD、CAT和POD等。

MDA［15］是膜脂過氧化最重要的產物之一，毒性很強，對生物膜的結構與功能具有嚴重損傷作用，其含量高低體現了氧自由基的毒害作用的大小，成為反映膜脂過氧化強弱的重要指標，因此植物在逆境中遭到傷害的程度可以通過MDA的含量來反饋。加入菌液后水葫蘆葉片中的MDA含量顯著高于對照，說明菌液對葉片的細胞膜有較強的毒害作用，從而抑制了水葫蘆植株的生長。SOD能將歧化為H2O2，是清除超氧陰離子自由基的關鍵酶之一，酶活性常與植物的抗氧化脅迫能力正相關。POD具有將H2O2轉化為H2O的作用，是植物體內擔負清除H2O2的主要酶類。CAT是植物中極為重要的逆境生理酶，能夠清除植物體內過多的過氧化氫，減少其對細胞的過氧化傷害，圖2的結果表明加入菌液后水葫蘆葉片的SOD、CAT、POD酶的活性顯著提高。

圖2 試驗組葉片與對照組葉片酶活的檢測結果Fig.2Results of enzyme activity on test group and control group

2.5 菌株S63對富營養化水質的凈化試驗

取富營養化水樣置室溫間歇曝氣，不同時間段取樣測定對照組與試驗組的氨氮和COD，結果表明加入S63菌液對氨氮和COD降解效果顯著高于對照(圖3)。加菌曝氣3 d的水樣明顯較對照清澈。

圖3 菌株S63對富營養化水樣的凈化試驗Fig.3The test of purification about eutrophic water with S63

3 討論

本研究篩選得到的菌株S63對水葫蘆的生長有抑制作用，加入菌液后水葫蘆葉片中的MDA含量及SOD、POD和CAT酶活均顯著高于對照，說明對葉片的細胞膜產生了較強的毒害作用，能引起植株的膜脂過氧化，造成植株過氧化損傷，致病率可達41.2%～100%，病情指數為30.9%～96.4%，明顯高于對照組。表明該菌有一定的殺草活性，但關于其損傷的機理和使用的安全性還需要進一步的研究。

人工、機械防除或化學除草劑難以根治水葫蘆的泛濫，生物防治方法是國際上認同的控制入侵生物的發展方向，采用對環境友好、成本低廉、選擇性強的微生物及其代謝產物作為殺草劑成為研究熱點［17-20］。水葫蘆病原菌的研究始于20世紀60年代，但目前具有商業化應用價值的微生物除草劑還很少見，且大部分都為致病真菌［3-5，16-17］，很少有關于水葫蘆致病細菌的研究報道。菌株S63是假單胞菌屬，擴大了水葫蘆生防菌的種類來源。該菌株還具有降解水體中氨氮的特性，對遏制水體富營養化有一定作用，而水葫蘆的爆發與水環境富營養化的關系密切，因此該菌株及其代謝物對水葫蘆泛濫具有標本兼治的防治作用，提供了一個水葫蘆生物防除的新思路，本研究的結果對這一領域的產品研發具有一定的參考價值，值得進一步深入的研究。

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Isolation and Screening of Herbicidal Active Strain S63 against Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)

CHEN Hong，JIA Wei，NIE Yi-lei，LUO Li-jin，CHEN Xing-wei
(Fujian Inst.of Microbiol.，Fujian Prov.Key Lab.of Screening for Novel Med.(Microb.)Products，Fuzhou 350007)

Water hyacinth(Eichhornia crassipes)(WH)agar plate and ammonia-nitrogen plate and dibbling on WH’s stem method were adopted to screen initially herbicidal active strains which could make WH infected with pathological change by black spot.The growth inhibition effects of WH was observed in illumination incubator，and obtained strain S63 that strongly inhibited the growth of WH，and identified as a species of the genus of Pseudomonas.The results of outdoors’cultivation experiments showed that the occurrence of WH tested groups with 0.5%～2%of the strain’s fermentation broth was at 41.2%～100%，higher than the occurrence of control groups at 19.4%～33.3%;and enzyme activities of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD) and catalase(CAT)in tested WH’s leaves were significantly higher than the control groups，suggested that the strain had a certain herbicidal activity against WH.

water hyacinth(Eichhornia crassipes);growth inhibition;Pseudomonas;bio-control

Q93－3

1005－7021(2016)04－0022－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.004

福建省科技重點項目(2013Y0013)

陳宏女，碩士，高級工程師。研究方向為環境微生物。E-mail:peaceful88@163.com

2015-11-02;

2016-01-12