硼類化合物在滴眼劑中抑菌效力的探討

肖璜，王似錦，周發(fā)友，馬仕洪，胡昌勤

(中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所，北京100050)

硼類化合物在滴眼劑中抑菌效力的探討

肖璜，王似錦，周發(fā)友，馬仕洪，胡昌勤*

(中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所，北京100050)

探討硼類化合物(硼酸、硼砂)在滴眼劑中的抑菌效力。通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同濃度的硼酸、硼砂供試品組，測定其抑菌效力。結(jié)果表明，在牛磺酸滴眼劑品種中，3組供試品組對真菌組達(dá)到抑菌效力的判斷標(biāo)準(zhǔn)。但在細(xì)菌組中，3組供試品組未達(dá)到抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)。在氯霉素滴眼劑中，白色念珠菌98001、金黃色葡萄球菌26003、銅綠假單胞菌10104組均滿足抑菌效力的判斷標(biāo)準(zhǔn)，但對大腸埃希菌44102未體現(xiàn)出明顯抑菌作用。硼類化合物(硼酸、硼砂)在1 mg/mL劑量下即具有一定的抑菌效力。因此在滴眼劑處方設(shè)計(jì)時(shí)，硼類化合物抑菌效力需被正視，同時(shí)需結(jié)合配伍注意控制使用劑量。

硼類化合物;硼酸;硼砂;抑菌效力

眼用制劑目前在售的主要為多劑量包裝。由于在使用和保存過程中存在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，多劑量眼用制劑一般通過添加抑菌劑，以防止或抑制微生物的生長繁殖。硼酸、硼砂作為硼酸鹽離子緩沖對在各種藥物制劑中被廣泛作為pH調(diào)節(jié)劑［1-2］，但在文獻(xiàn)收集過程中發(fā)現(xiàn)，在中藥領(lǐng)域，已發(fā)現(xiàn)硼酸、硼砂的抗菌作用［3］，在食品領(lǐng)域，硼類化合物的毒害已引起人們的關(guān)注［4］。目前，在滴眼劑制劑過程中常用的抑菌劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)通常分為五類:季銨鹽類(苯扎溴銨、苯扎氯銨)、有機(jī)汞類(硫柳汞、醋酸苯汞)、醇類(三氯叔丁醇、苯甲醇)、對羥基苯甲酸酯類(羥苯乙酯、羥苯甲酯)、酸及其鹽類(山梨酸、醋酸氯已定)［5］。但是硼酸、硼砂在滴眼劑中的抑菌效力尚未見有研究報(bào)道。在近年的全國藥品評價(jià)性抽驗(yàn)中，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室承擔(dān)滴眼劑品種的抑菌效力研究工作，所以對于處方中對最終制劑抑菌效力具有影響的物質(zhì)進(jìn)行了持續(xù)的關(guān)注和研究［6-8］。在此對研究結(jié)果進(jìn)行討論展示。希望獲得更多相關(guān)制劑方面人員的關(guān)注，以進(jìn)一步完善滴眼劑處方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104、大腸埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B)44102、白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001、黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98003均來自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，以上菌種均使用第3代菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)無菌平皿培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂(TSA)無菌平皿培養(yǎng)基均購于上海諾狄生物科技有限公司。

1.1.3 試劑硼酸和硼砂均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌采用TSA培養(yǎng)基，32.5℃培養(yǎng)18～24 h;白色念珠菌采用SDA培養(yǎng)基，22.5℃培養(yǎng)48 h，以上菌株均采用比濁法用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌量約為107～108cfu/mL的菌懸液。黑曲霉采用SDA斜面培養(yǎng)基，22.5℃培養(yǎng)7 d，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫，制成含菌量約為107～108cfu/mL的孢子菌懸液。

1.2.2 供試品配置供試品均以無菌水進(jìn)行配置，其中牛磺酸采用A、B、C三組供試品，氯霉素采用D組供試品。具體配置成分為A組:1 mg/ mL硼酸;B組:0.5 mg/mL硼酸和0.5 mg/mL硼砂;C組:1 mg/mL硼砂;D組:15.8 mg/mL硼酸和0.65 mg/mL硼砂。供試品分別裝量至離心管中，每管10 mL。

1.2.3 抑菌效力測定參照藥典標(biāo)準(zhǔn)按1%量加菌，使供試品內(nèi)5株菌的菌液終濃度為105～106cfu/mL，充分混勻，置22.5℃避光保存，參照2010版和2015版中國藥典，分別在0 h、6 h、24 h、7 d、14 d、28 d對供試品中存活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，依據(jù)相應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)背景

基于2015年全國藥品評價(jià)性抽驗(yàn)中本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的牛磺酸滴眼劑品種和2013年本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的氯霉素滴眼劑品種，在前期調(diào)研廠家處方和匯總市場抽驗(yàn)收樣信息后確定供試品濃度。目前市場上牛磺酸滴眼劑產(chǎn)品處方中硼酸、硼砂的最大投料量均為1 mg/mL。同時(shí)，處方中僅有少數(shù)廠家同時(shí)投料硼酸、硼砂作為緩沖對使用，多數(shù)廠家單獨(dú)投料硼砂。在前期文獻(xiàn)收集中，見最低濃度為2%硼酸濃度眼部刺激的報(bào)道［9］，因此在配置時(shí)選擇最大投料量作為單獨(dú)投料組和投料量中值作為緩沖對組配置供試品進(jìn)行考察。

市場上氯霉素滴眼劑產(chǎn)品處方中硼酸、硼砂的投料量差異極大，同時(shí)較牛磺酸滴眼劑產(chǎn)品處方中投料量高出很多，且多為緩沖對共同使用，故本次研究選擇硼酸、硼砂的投料中位值:硼酸15.8 mg/mL和硼砂0.65 mg/mL配置緩沖對組供試品進(jìn)行考察。

2.2 牛磺酸滴眼劑抑菌效力

牛磺酸滴眼劑抑菌效力測試結(jié)果見圖1。根據(jù)藥典相關(guān)要求，圖中均為菌數(shù)lg值。

在2010版中國藥典抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則中規(guī)定滴眼劑抑菌劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)為“細(xì)菌:7 d菌數(shù)下降不少于1.0 lg，14 d菌數(shù)下降不少于3.0 lg，14～28 d菌數(shù)不增加;真菌:與初始值比，7、14、28 d菌數(shù)均不增加”。其中不增加是指試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過0.5 lg。在真菌(白色念珠菌98001和黑曲霉菌98003)組中，可見3組供試品組達(dá)到抑菌效力的判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，白念珠菌組7、14、28 d菌數(shù)較初始菌數(shù)均不增加;而黑曲霉組中緩沖對組(B)和硼砂組(C)7、14、28 d菌數(shù)較初始菌數(shù)均不增加，硼酸組(A)28 d菌數(shù)下降了1.0 lg。在細(xì)菌(金黃色葡萄球菌26003、銅綠假單胞菌10104、大腸埃希菌44102)組中，3組供試品組未達(dá)到抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)。但通過數(shù)據(jù)比較可發(fā)現(xiàn)，硼酸組(A)的抑菌效力比緩沖對組(B)和硼砂組(C)稍高:金黃色葡萄球菌28 d菌數(shù)下降1 lg，比其他兩組菌數(shù)下降更多;銅綠假單胞菌菌數(shù)呈下降趨勢，而其他兩組菌數(shù)均呈上升趨勢。

由此可見，在1 mg/mL投料量下，硼酸、硼砂兩種硼類化合物均具有一定的抑菌作用，抑菌效果在真菌組表現(xiàn)最為明顯。

圖1 牛磺酸滴眼劑供試品組不同監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)菌落計(jì)數(shù)lg值結(jié)果Fig.1lg values of colony count at different time points in the testing taurine eye drops groups

2.3 氯霉素滴眼劑抑菌效力

由于牛磺酸滴眼劑硼酸組(1 mg/mL)中，真菌(黑曲霉98003)表現(xiàn)了較強(qiáng)的抑菌性，因此在氯霉素滴眼劑硼酸投料量為15.8 mg/mL情況下，對黑曲霉并未做考察。抑菌效力測試結(jié)果見圖2。根據(jù)藥典相關(guān)要求，圖中均為菌數(shù)lg值。

圖2 氯霉素滴眼劑供試品組不同監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)菌落計(jì)數(shù)lg值結(jié)果Fig.2lg values of colony count at different time points in the testing chloramphenicol eye drops groups

由圖2可見，真菌(白色念珠菌98001)組和細(xì)菌(金黃色葡萄球菌26003、銅綠假單胞菌10104)組均滿足2010版藥典規(guī)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)數(shù)據(jù)均較圖1中下降顯著。同時(shí)，細(xì)菌(大腸埃希菌44102)組與牛磺酸滴眼劑中3組供試品組相同，均未體現(xiàn)出明顯抑菌作用。

從抑菌效力大小比較，氯霉素滴眼劑處方中硼酸、硼砂中位值緩沖對組抑菌效力顯著高于牛磺酸滴眼劑處方中硼酸最大投料量組和硼砂最大投料量組。

3 討論

3.1 抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)改變

2015年12月1日，中國藥典執(zhí)行版本將由2010版改為2015版。需要指出的是，2015版藥典中抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)針對新產(chǎn)品研發(fā)審批，而已有上市品種的評估仍延用2010版藥典標(biāo)準(zhǔn)。

在2015版中國藥典1121抑菌效力檢查法中規(guī)定眼用制劑抑菌效力判斷分為A標(biāo)準(zhǔn)和B標(biāo)準(zhǔn)。A標(biāo)準(zhǔn)為“細(xì)菌:6 h菌數(shù)下降不少于2 lg，24 h菌數(shù)下降不少于3 lg，28 d試驗(yàn)菌未恢復(fù)生長;真菌:7 d菌數(shù)下降不少于2 lg，28 d菌數(shù)不增加”;B標(biāo)準(zhǔn)為“細(xì)菌:24 h菌數(shù)下降不少于1 lg，7 d菌數(shù)下降不少于3 lg，7 d到28 d菌數(shù)不增加;真菌:14 d菌數(shù)下降不少于1 lg，14 d到28 d菌數(shù)不增加”。A標(biāo)準(zhǔn)是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，則至少應(yīng)達(dá)到B的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。比較2010版藥典和2015版藥典中標(biāo)準(zhǔn)要求，2015版藥典增加了6 h和24 h的觀測點(diǎn)，即使是相對要求低的B標(biāo)準(zhǔn)，仍比2010版藥典要求更加嚴(yán)格。牛磺酸滴眼劑品種6 h和24 h菌數(shù)結(jié)果中，金黃色葡萄球菌(26003)、大腸埃希菌(44102)、黑曲霉菌(98003)確實(shí)呈現(xiàn)了菌數(shù)增長的趨勢。而6 h和24 h的觀察期，恰恰是患者在滴眼液使用過程中可能的間隔時(shí)段，因此，監(jiān)測點(diǎn)的增加，能夠更好地模擬因使用不當(dāng)造成的污染。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用中體現(xiàn)的抑菌劑不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，一直是近年來研究人員關(guān)注的話題［10-11］。這一問題，更多的應(yīng)該從處方設(shè)計(jì)的角度去解決和避免。但在本實(shí)驗(yàn)室對滴眼劑連續(xù)跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，我國滴眼劑現(xiàn)有品種中處方設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)較為薄弱。

3.2 硼類化合物抑菌效力

對比兩次實(shí)驗(yàn)處方采集數(shù)據(jù)可見，氯霉素滴眼劑商品配方中硼類化合物(硼酸、硼砂)投料量顯著高于牛磺酸滴眼劑商品配方。然而，氯霉素滴眼劑中主藥氯霉素本身屬于抗生素類品種，具有廣譜抗菌性;牛磺酸滴眼劑中主藥牛磺酸為體內(nèi)合成能力弱，主要依靠外源攝入的體內(nèi)存在的條件必須氨基酸［12］，未見抗菌報(bào)道。在非抗生素類滴眼劑中，具有低抑菌效力的硼類化合物使用較少，而抗生素類滴眼劑中，硼類化合物使用較大。此類滴眼劑處方設(shè)計(jì)的合理性值得思考。有報(bào)道指出硼砂與青霉素、頭孢菌素、先鋒霉素、呋喃旦啶、四環(huán)素類藥物共同使用，可減少這些藥物的再吸收，降低治療效果;與氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、妥布霉素同用，均使毒副作用增加，甚至危及生命［3］。同時(shí)有報(bào)道指出，在抗生素類滴眼劑利福平品種中，使用磷酸鹽緩沖液相對于硼酸鹽緩沖液更為合理，不會(huì)發(fā)生配位反應(yīng)生成新的化合物［2］。因此，抗生素類滴眼劑中硼類化合物的使用合理性需要引起相關(guān)制劑專業(yè)人士重視。如果目前生產(chǎn)工藝仍需使用硼類化合物，那么其用量也需進(jìn)行考察。牛磺酸滴眼劑處方單獨(dú)最大投料量(1 mg/mL)供試品組中硼酸、硼砂兩類硼類化合物均具有一定的抑菌作用。氯霉素滴眼劑處方中位值投料量(硼酸15.8 mg/mL和硼砂0.65 mg/mL)供試品組抑菌作用極強(qiáng)。然而，有報(bào)道在兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)中單次給藥2%硼酸即造成輕微刺激，而多次給藥造成中度刺激［9］。因此，硼類化合物的投料量在增大的同時(shí)也意味著使用過程中不良反應(yīng)發(fā)生率的提高，需要綜合考慮增大投料量導(dǎo)致的各種后果。

綜上所述，硼類化合物在低劑量(1 mg/mL)即具有一定的抑菌效力，在滴眼劑處方研發(fā)階段需考慮其抑菌效力和配伍并控制使用劑量。同時(shí)，在滴眼劑制劑過程中除作為pH調(diào)節(jié)劑使用外，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，硼類化合物應(yīng)歸于酸及其鹽類的抑菌劑。

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The antimicrobial effect of boron compounds in the eye drops

XIAO Huang，WANG Si-jin，ZHOU Fa-you，MA Shi-hong，HU Chang-qin
(Inst.for Chem.Drug Control，National;Acad.for Food＆Drug Control，Beijing 100050)

The microbial inhibition effects of boric compounds(boric acid，borax)in the eye drop formulation were investigated through designing different concentration of tested boric acid and borax and determination of their microbial inhibition effects.The results showed that boric compounds(boric acid，borax)had antimicrobial effect when the concentration level was above 1 mg/mL.Therefore，when designing the eye drop prescription，the microbial inhibition effect of boric compounds should be faced up to.At the same time when combining with the compatibility and the control of using dose it need to pay attention.

boric compounds;boric acid;borax;microbial inhibition effect

Q939.9;R988.1

A

1005－7021(2016)04－0058－04

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.010

2015年國家藥品抽驗(yàn)任務(wù)完善標(biāo)準(zhǔn)專題(55)

肖璜女，助理研究員，碩士。從事藥品微生物檢驗(yàn)工作。Tel:010-67095509，E-mail:anyway00000@126.com

*通訊作者。男，研究員，博土生導(dǎo)師。主要從事藥物質(zhì)量分析與質(zhì)量評價(jià)的研究。Tel:010-67095308，E-mail:hucq@nifdc.org.cn

2016-03-22;

2016-04-26