響應曲面法優化Gluconobacter melanlgenu X42培養基

陳羽，徐威，位星，胡思宇

(沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧沈陽110016)

響應曲面法優化Gluconobacter melanlgenu X42培養基

陳羽，徐威*，位星，胡思宇

(沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧沈陽110016)

采用Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗和中心組合試驗相結合的策略對Gluconobacter melanlgenu X42轉化培養基進行優化。試驗結果表明:最佳轉化培養基組成為麥芽抽提物0.46 g/L、蛋白胨2.07 g/L、CaCO30.70 g/L、ZnSO40.04 g/L。優化后L-山梨糖生成量提高了9.9%?？梢詰庙憫娣▽.melanlgenu X42轉化培養基進行優化。

生黑葡萄糖酸桿菌;培養基;響應曲面法;L-山梨糖;條件優化

維生素C是一種水溶性維生素，能夠參與體內多種羥基化反應和氧化還原反應，是一類重要的細胞代謝氧化還原化合物［1］。我國發明的維生素C“二步發酵法”是經生黑葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter melanlgenu)轉化D-山梨醇為L-山梨糖，再經過細菌發酵生成維生素C前體2-酮基-L-古龍酸［2］。響應曲面法(Response Surface Methodology)是一種通過合理的實驗設計來收集數據，應用曲面模型及各影響因素的二次多項式來評估反應變量變化規律的設計方法。因其能恰當地利用實驗設計所收集的數據，有效地評估模型中的參數，受到國內外各科學領域的廣泛關注［3-4］。本研究采用響應曲面法對所構建的基因工程菌G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)的轉化培養基進行優化，以期為企業在大規模生產中節約能耗、降低生產成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)由本課題組保藏。

1.1.2 培養基(g/L)種子培養基:山梨醇160，麥芽提取物5，CaCO32.50;轉化培養基:山梨醇230，蛋白胨2，麥芽提取物0.40，CaCO30.70，ZnSO40.04。

1.2 方法

1.2.1 L-山梨糖含量的測定L-山梨糖含量的測定參見文獻［5］。

1.2.2 Plackett-Burman試驗設計保持D-山梨醇含量不變，采用Plackett-Burman(PB)試驗對麥芽抽提物(X1)、蛋白胨(X2)、CaCO3(X3)和ZnSO4(X4)進行考察。每個因子取2個水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為－1，篩選對L-山梨糖產量影響顯著的因素，各因子水平取值見表1。

表1 試驗因子和水平設計Table 1Design of experimental factors and levels

1.2.3 最陡爬坡試驗設計以PB設計挑選出對響應值影響顯著的因素設計最陡爬坡試驗，確定爬坡方向和變化步長。

1.2.4 中心復合設計和響應面分析試驗基于PB試驗和最陡爬坡試驗結果，采用響應面分析尋求最佳培養基優化條件。

1.2.5 響應面模型驗證按照模型預測的最佳組分配比制備培養基，連續進行5批搖瓶轉化試驗，驗證模型的有效性。

2 結果與分析

2.1 Placket-Burmen試驗

以L-山梨糖生成量Y作為響應值，進行PB試驗設計，試驗結果見表2。對表2中的PB設計結果進行線性回歸擬合(表3)，可得到一次回歸方程Y=221.83+2.67X1+2.92X2+1.00X3－1.08X4。方程決定系數R2為91.17%，表明該回歸方程擬合良好。由表3中的P值可知，麥芽抽提物和蛋白胨是影響L-山梨糖生成量最顯著的因素。

表2 Plackett-Burmen設計試驗結果Table 2Experimental result of Plackett-Burmen design

表3 Plackett-Burman設計回歸分析Table 3Regression analysis of Plackett-Burmen design

2.2 最陡爬坡試驗

其他因素保持原始水平不變，對X1、X2兩個顯著因素進行最陡爬坡試驗。由表4可知，最優條件在4組附近，故以其為后續響應曲面試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗結果Table 4Experimental results of slope-climbing test

2.3 中心復合試驗設計和響應面分析試驗

其他因素保持原始水平不變，根據最陡爬坡試驗得到的中心點，X1、X2進行中心組合試驗設計(表5)。中心組合試驗結果見表6。對表6中的試驗結果進行回歸擬合(表7)，得到一個二元二次方程:Y=237.00+2.08X1－2.02X2+3.25X1X2－6.66X12－5.78X2

2。方程決定系數R2為98.34%，表明方程擬合較好。

表5 中心組合試驗變量及水平Table 5Variables and levels of central composite test

表6 中心組合試驗結果Table 6Experimental results of central composite test

表7 中心組合試驗回歸分析Table 7Regression analysis of central composite test

將響應值進行擬合后得到響應曲面圖見圖1。利用Design Expert 8.0軟件可以得到模型極值，X1=0.46 g/L，X2=2.07 g/L。保持其他因素不變，預測L-山梨糖最大生成量為237.3 g/L。

2.4 響應面模型驗證

按照模型預測的最佳組分配比制備培養基，連續進行5批搖瓶轉化試驗，驗證模型的有效性，試驗結果見表8。由表8可以看出，優化培養基L-山梨糖生成量平均值為237.5 g/L，比初始培養基L-山梨糖生成量(平均值為216.2 g/L)提高了9.9%，展示出優化培養基的優越性。

表8 驗證實驗結果Table 8The result of the validation experiment

圖1 麥芽抽提物與蛋白胨的交互響應曲面Fig.1Response surface stereogram for malt extract and peptone

3 討論

G.melanlgenu在轉化D-山梨醇的過程中，山梨醇較黏稠，嚴重影響氧氣的傳遞速度。因此，在維生素C發酵生產的過程中，氧傳遞速度是一個生產瓶頸，供氧己成為提高產品產量的主要限制因素之一。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)是一種具有氧結合與傳遞能力，能在極低的溶氧水平下被大量誘導合成的血紅蛋白。自被發現以來便引起各國科學家的廣泛關注，其研究也為解決供氧問題提供了一個新的思路［6-8］。我們借助基因工程技術，實現了透明顫菌血紅蛋白基因在G.melanlgenu中的克隆與表達。通過前期的單因素考察試驗，發現轉化培養基中蛋白胨、麥芽提取物、CaCO3和ZnSO4對G.melanlgenu X42轉化D-山梨醇影響顯著。本研究采用響應曲面設計中的中心復合設計，建立了優化G.melanlgenu X42轉化培養基組分的二次多項數學模型，利用模型的響應面對轉化培養基各組分進行探討，確定了培養基組分的最佳水平范圍，優化出轉化培養基中各種成分的濃度為麥芽抽提物濃度0.46 g/L，蛋白胨濃度2.07 g/L，CaCO3濃度0.70 g/L，ZnSO4濃度0.04 g/L。采用搖瓶轉化試驗驗證模型的有效性，結果顯示，與初始轉化培養基相比，優化培養基L-山梨糖生成量提高了9.9%，展示出響應曲面法優化培養基的優越性。

傳統的培養基優化一般采用單因素試驗方法，但單因素試驗不能考察到因素間的相互作用。PB設計能快速準確地從影響L-山梨糖生成量的眾多因素中篩選出最重要的影響因素，并能為爬坡試驗指出方向和變化步長，接近最大產量區域。之后根據爬坡試驗得到的中心點進行中心組合試驗，并運用響應面分析方法，回歸擬合中心組合試驗數據，得到能與實際情況擬合良好的模型方程，進而確定最適的培養基組成［9-10］。

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Gluconobacter melanogenus X42 Medium Optimized by Response Curved Surface Methodology

CHEN Yu，XU Wei，WEI Xing，HU Si-yu
(Schl.of Life Sci.＆Biopharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang 110016)

The transformation medium of Gluconobacter melanogenus X42 was optimized with the tactics of Plackett-Burman design，slope-climbing test and central combination test.The experimental results showed that the optimum transformation medium components were:malt extract 0.46 g/L，peptone 2.07 g/L，CaCO30.70 g/L and ZnSO40.04 g/L.L-sorbose production was increased by 9.9%after the optimization.G.melanogenus X42 transformation medium could be optimized by the response curved surface methodology.

Gluconobacter melanogenus;medium;response curved surface methodology;L-sorbose;conditions optimization

Q815

A

1005－7021(2016)04－0067－04

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.012

遼寧省教育廳一般項目(L2013380);遼寧省教育廳高等學校創新團隊項目(LT2014023)

陳羽男，講師，碩士。主要從事微生物轉化及基因工程菌改造研究。E-mail:gzweishengwu@126.com

*通訊作者。女，教授，博士，碩士生導師。主要從事微生物制藥及微生物轉化合成生物活性物質的研究。

E-mail:shxuwei8720@163.com

2015-11-16;

2016-01-20