CDK8缺失和/或SHP-2過表達后對SiHa 細胞增殖能力的影響

孟 斐

（沈陽醫學院附屬中心醫院婦產科，遼寧 沈陽 110024）

CDK8缺失和/或SHP-2過表達后對SiHa 細胞增殖能力的影響

孟 斐

（沈陽醫學院附屬中心醫院婦產科，遼寧 沈陽 110024）

目的研究CDK8缺失和/或SHP-2過表達后對SiHa 細胞增殖能力的影響。方法 選取SiHa 細胞，利用RNA干擾技術，敲除CDK8，干擾CDK8蛋白表達；利用質粒轉染技術高表達SHP-2蛋白。采用免疫印跡技術檢測CDK8和SHP-2蛋白表達，同時觀察并檢測SiHa 細胞的增殖能力的情況。結果 實驗結果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力； SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化。結論 在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2過表達影響SiHa 細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞存在相關性。

CDK8；SHP-2；SiHa 細胞；增殖能力

世界范圍內發病率在女性惡性腫瘤中排第二位的是宮頸癌[1]。當前，宮頸癌是婦科腫瘤中少量已找到明確病因的腫瘤之一，其發病主要是由于人乳頭瘤病毒（HPV）感染后引發機體內源性反應，如激活有關癌基因、抑癌基因活性受到抑制和整個基因組機體免疫調節機制紊亂等一系列病理性改變，進而引發細胞增殖與凋亡的反常，致使正常組織發生癌變[2]。由本課題組以前的研究可知SHP-2在宮頸組織是HPV感染的免疫應答反應中的負性調節因子；CDK8是一個已知的致癌基因，且在宮頸癌中高表達；SHP-2在宮頸病變發生發展中的免疫調節機制，是誘導產生的TGF-β通過CDK8的調節來實現的。本文主要探討在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2的高表達是否影響SiHa細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SiHa細胞，CCK8（DojinDo，日本），0.25%Trypsin-EDTA(1X)（Gibco，美國），Fetal Bovine Serum（Gibco，美國），96孔板（Corning，美國），酶標儀（Molecular Device，美國），倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染靶細胞

第1d，以合適的比例接種靶細胞于T25的培養瓶中（兩組，對照組和處理組）。第2d，感染前，病毒原液從-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/ml Polybrene的新鮮培養基按合適的MOI值稀釋病毒原液，吸除對照組和處理組原有的培養基，含有慢病毒陰性對照稀釋液加到對照組細胞中，含有CDK8敲低和SHP2過表達的慢病毒稀釋液加到SiHa細胞中 (換液時間可根據細胞狀態可適當延長)。第3d，感染效率檢測，實時定量PCR驗證CDK8的敲低效果；WB驗證SHP2的過表達效果。

1.2.2 細胞準備

小心吸去培養液，用1xPBS清洗，棄掉1×PBS后，加入適量胰酶；在顯微鏡下觀察細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。棄去胰酶，加入適量預熱的新鮮培養液，將細胞吹打分散均勻，將細胞懸液吸入15mL離心管中，室溫，800rpm，離心5min ，棄去培養液，加入新鮮培養液，將細胞吹打均勻，血球計數板計數。

1.2.3 常規培養

以3000個（100μL）/孔的密度鋪于96孔板中，37℃，5%CO2，常規培養。

1.2.4 MTT實驗

分別于24h，48h，72h，96h，120h后，在相應的孔（100μL培養液）中加入10μLCCK8（3復孔），37℃孵育2h后，450nm 測定吸光度（OD450）。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

實驗結果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力； SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化，見圖1，圖2。

圖1 實驗結果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力

圖2 SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化

3 討 論

惡性腫瘤的發生過程是極其復雜的，它可以通過很多種不同的途徑發生，惡性腫瘤的發生發展是一個漫長的過程，要經過許多不同的階段，在惡性腫瘤發展的過程中細胞可能會過度增殖，而凋亡卻可能受到抑制，這種機體的平衡失控可能是腫瘤發展的因素之一[3]，因此抑制腫瘤細胞增殖和誘導其凋亡是治療腫瘤的方向之一。

CDKs在細胞增殖和分化中發揮重要的調控作用[4-5]，當CDK8調控作用發生異常時，將導致細胞增殖、分化或凋亡的異常，從而導致發育異常或疾病的發生[6-7]。人類某些癌癥與CDK8的功能失調與過度表達存在相關性[8]。近來發現，SHP-2參與了許多人類疾病的發病，而轉基因小鼠模型的建立證實SHP-2在免疫系統中發揮作用。科學研究已證實，激活免疫反應的，是機體內一類天然免疫識別受體“家族”，學名叫做Toll樣受體。它們能識別病毒，“通知”

免疫細胞，并“誘導”后者產生抗病毒的炎癥細胞因子和I型干擾素等。安華章等發現：SHP-2是免疫系統的“剎車蛋白”，它在免疫反應中起負向調控作用。每每免疫反應被激活，就會有一類名為SHP的蛋白磷酸酶伴隨出現。進一步研究顯示，SHP-2分子正是免疫系統中的“剎車”，當病原體統統被消滅后，SHP-2會“喊停”，讓免疫反應適可而止。一旦身體狀況出現異常，“剎車”便“失靈”了，給了疾病可乘之機[9]。

本組資料中選取SiHa 細胞，利用RNA干擾技術，敲除CDK8，干擾CDK8蛋白表達；利用質粒轉染技術高表達SHP-2蛋白。采用免疫印跡技術檢測CDK8和SHP-2蛋白表達，同時觀察并檢測SiHa細胞的增殖能力情況，結果顯示CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力；SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化，說明了在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2的表達影響SiHa 細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞存在相關性。

[1] Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[2] 王艷萍,徐 靜,張麗鈺,等.中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞抑制作用的影響[J]. 中國老年學雜志,2016,36(8):1822-1825.

[3] 于妍妍.中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響[J].疑難病雜志,2008,8(9):531-533.

[4] 李 斌,張志強.腫瘤干細胞標記物eo133和pCAM在子宮內膜癌中的表達及意義[J].中國腫瘤臨床,2012,39(7):1281-1282．

[5] 李世金,張愛臣.CDK8在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義[J].中國實驗診斷學,2013,17(1):88-90．

[6] 王麗琴.子宮內膜癌臨床診治的研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復,2012,19(5):472-474．

[7] 鄧赫男.宮內膜癌分子標志物與臨床病理特征及預后的關系[J].河北醫學,2014,20(4):631-632．

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[9] 孟 斐.SHP-2在HPV致宮頸癌中的免疫作用[D].中國醫科大學,2010.

R711.74

A

ISSN.2095-8803.2016.10.017.02