雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

閆瀚坤，張雪銘，劉保臻＊，吳玉臣

（1.睢縣畜牧局，河南 睢縣 476900；2.河南牧業經濟學院）

雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

閆瀚坤1，張雪銘2，劉保臻2＊，吳玉臣2

（1.睢縣畜牧局，河南 睢縣 476900；2.河南牧業經濟學院）

用飼料廠常用飼料添加劑對臨床分離的沙門氏菌進行藥敏試驗，為飼料廠選用合適飼料添加劑提供參考。從河南各地養雞場蛋雞病料（雞白痢疑似病例）中分離出沙門氏菌，選取臨床常用幾種不同的抗菌藥物以4個濃度梯度自制藥敏片，藥敏試驗測定它們的抑菌效果。此次分離的沙門氏菌對金霉素和喹乙醇低敏，且各類飼料添加劑濃度梯度間的效果差異不顯著（P＞0.05），在高濃度下對硫酸粘桿菌素高敏，在中低濃度下對硫酸粘桿菌素中敏，各地區間的效果差異不顯著。

雞白痢；沙門氏菌；分離鑒定；抑菌濃度；藥敏試驗

沙門氏菌病是各種動物由沙門氏菌屬細菌引起的疾病總稱，臨診上患雞白痢的雛雞多表現為排稀薄糊狀糞便，成年雞產蛋率、受精率、孵化率下降。蛋內感染的雛雞，形成死胚或弱雛，出殼不久無癥狀死亡。出殼后感染的，4～5日齡常呈無癥狀急性死亡，7～10 d發病增多，2～3周齡達到高峰，死亡率達40%～70%。3周齡以上較少死亡，不死者終生帶菌［1-2］。該研究通過對蛋雞病料（雞白痢疑似病例）進行病原的分離、鑒定，選用幾種臨床常用藥物飼料添加劑分別以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4個濃度梯度稀釋成混懸液，自制藥敏片對病原分離株進行藥敏試驗，以測定病原分離株對不同濃度的常用藥物飼料添加劑的敏感程度，確定藥物飼料添加劑的品種和參考用量，為制定合理的防制措施提供科學依據，提高養殖戶的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物飼料添加劑 50%喹乙醇，每噸飼料中添加200 g；20%金霉素，每噸飼料中添加250 g；10%硫酸粘桿菌素，每噸飼料中添加200 g。

1.1.2 病料 來自開封、洛陽、信陽、新鄉規模化蛋雞場，采集自然發病雞（雞白痢疑似病例）的肝、脾及泄殖腔分泌物［3］。

1.1.3 主要試劑 麥康凱瓊脂，SS瓊脂培養基，MH瓊脂，營養瓊脂，營養肉湯。

1.1.4 主要用品 “雙圈牌”定性濾紙，微量生化鑒定管。

1.1.5 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器，數顯電熱培養箱，超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原分離 將采集的病樣無菌操作接種于普通營養肉湯培養基中，37℃溫箱內增菌培養12～24 h。然后，用接種環蘸取少量普通肉湯分別在SS、麥康凱和普通瓊脂平板上劃線，置于37℃培養24 h。觀察平板上單個菌落的顏色、大小、光滑度、濕潤度和透明度，挑取獨立、較大的疑似沙門氏菌菌落進行染色鏡檢，觀察到符合沙門氏菌形態及染色特征的菌落的其余部分接種于普通瓊脂斜面進行增菌備用。

1.2.2 生化鑒定 制備三糖鐵和生化試驗培養基，將鏡檢符合沙門氏菌的純培養物進行糖類發酵試驗及生化反應，主要包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、尿素酶、靛基質、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽產氣試驗、硫化氫試驗等。

1.2.3 藥敏試驗

1.2.3.1 藥敏片的制備 選質量較好的濾紙片，用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的紙片，每50片放入一個潔凈干燥的青霉素小瓶中，裝32瓶，121℃高壓滅菌15 min，取出后放入溫箱，干燥備用。在無菌條件下，將新霉素、硫酸粘桿菌素、硫酸安普霉素、金霉素、喹乙醇、泰樂菌素、土霉素、林可霉素以添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4種濃度梯度配成混懸液。將藥敏片放入配制好的混懸液中，混合均勻后用鑷子夾出，放入4℃冰箱冷藏，將藥敏片平鋪在滅菌平皿中放入37℃溫箱中干燥后，放入滅菌青霉素小瓶中加蓋滅菌橡皮塞，4℃保存備用。

1.2.3.2 MH平板的制備 在無菌條件下，將滅菌后的MH瓊脂傾注至無菌平皿，待培養基冷卻后形成4 mm的平板。取出一個MH平板置于37℃溫箱中培養24 h做無菌試驗，其余用密封袋封好置4℃冰箱保存，備用。

1.2.3.3 試驗方法 采用藥物紙片瓊脂擴散法。用無菌小棉簽蘸取菌液，在管壁上旋轉擠壓去掉多余菌液，涂布整個MH瓊脂培養基表面，反復3次，每次將平板旋轉60°，最后沿周邊繞兩圈，保證涂布均勻。貼上制備好的藥敏紙片，每塊平板貼同種藥的藥敏片4種濃度各1片。將平板倒置，37℃孵育18～24 h后取出，測量抑菌圈直徑。抑菌圈不明顯的和抑菌圈過大的平板要做補充試驗。

2 結果與分析

2.1 病原菌的培養特性

分離的病原菌在普通瓊脂培養基上形成圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色、直徑2～3 mm的菌落；在麥康凱瓊脂培養基上形成無色、透明的菌落；在SS瓊脂培養基上形成無色、透明或半透明、中央顯黑色的菌落；在普通營養肉湯中生長貧瘠，形成較小菌落。革蘭氏染色鏡檢可見紅色、兩端鈍圓、短桿狀，單個、成對或成叢排列。以上結果均符合沙門氏菌特征。

2.2 分離菌的生化試驗

對分離到的致病菌進行了如下（表1）生化試驗，結果均符合沙門氏菌的特征。

表1 分離菌的生化試驗結果

2.3 藥敏試驗

以抑菌圈直徑大小作為敏感性高低的標準，直徑越大表明細菌對該藥的敏感性越高。藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的標準進行對照。抑菌圈直徑在15 mm以上為高敏，10～14 mm為中敏，10 mm為低敏，0 mm為耐藥［4］，結果顯示平均抑菌圈直徑隨藥品溶液濃度增大而增大，不同藥物的作用效果有顯著差異，但各濃度梯度間及各地區間差異不顯著（P＞0.05）（見表2）。此次分離到的致病性沙門氏菌菌株對金霉素和喹乙醇低敏，在中低濃度下對硫酸粘桿菌素中敏，在高濃度下對硫酸粘桿菌素高度敏感，沙門氏菌對金霉素和喹乙醇的耐藥性較高。

3 討論

通過對來自開封、信陽、洛陽、新鄉自然發病疑似雞白痢病雞體內病原菌的分離鑒定及生化試驗，確診為沙門氏菌引起的雞白痢。選取3種臨床常用藥品飼料添加劑，分別以常用添加量的1倍、2倍、4倍、6倍4個濃度梯度制作藥敏片對分離鑒定株進行藥敏試驗，結果顯示隨著金霉素和喹乙醇藥物濃度的升高，沙門氏菌對藥物的敏感性降低，不同藥物的作用效果有顯著差異，但各地區間差異不顯著（P＞0.05）。

該次試驗從病雞體內分離到雞白痢沙門氏菌，并通過藥物敏感性試驗對該菌的藥物敏感性做了初步研究。試驗結果表明，隨著飼料添加劑濃度的增加，沙門氏菌對金霉素和喹乙醇的敏感性降低，可以看出對金霉素和喹乙醇呈現出不同程度的耐藥性，且有報道稱家禽在使用喹乙醇中有中毒現象［5］。硫酸粘桿菌素可以用于治療沙門氏菌引起的腸道感染、腹瀉等，該研究證實硫酸粘桿菌素在中低濃度下對沙門氏菌中等敏感，這與李夢云等［6］的研究結果一致，在高濃度下對沙門氏菌高度敏感、有明顯的抑菌效果，但過度使用亦可能造成細菌產生耐藥性，因此，建議在臨床使用其進行促生長時不可盲目加大劑量。近年來，濫用這幾類抗微生物藥，已經造成敏感菌產生了巨大的耐藥性，為感染性疾病的治療帶來了巨大的困難。因此，應對患病區域進行定點定時監測，防止由于盲目用藥而造成耐藥敏感菌產生，減少由此帶來的經濟損失［7-8］。同時應加強飼養管理，增強抗病能力；對于患病豬進行無害化處理，做好消毒工作，保持良好的衛生條件。

表2 不同藥物的作用效果

［1］陳溥言.獸醫傳染病學［M］.北京：中國農業出版社，2013.

［2］甘孟侯.禽病診斷與防治［M］.北京：中國農業出版社，2002.

［3］鐘興福，黃小華，何旭梅，等.家禽病料的采集及注意事項［J］.廣西畜牧獸醫，2013，29（6）：350-351.

［4］韓春.豬源致病性大腸桿菌的流行調查及藥敏試驗［J］.中國畜禽業，2014，（1）：113-115.

［5］張忠群.家禽幾種藥物中毒及其應對措施［J］.養殖技術顧問，2012，（2）：143-143.

［6］李夢云，胡迎利，喬宏興，等.硫酸粘桿菌素體外抑菌效果的研究［J］.鄭州牧業工程高等專科學校學報，2014，34（2）：8-10.

［7］辛文娟，朱斌斌.肉雜雞白痢的診斷與治療［J］.中獸醫醫藥雜志，2014（1）：66.

［8］陳江.雞白痢的診斷與治療［J］.中國畜牧獸醫文摘，2016，32（3）：215.

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1004-5090（2016）12-0003-03

2016-10-13）