糜子雄性不育突變體的創制和遺傳分析

李海權，相金英，韓玉翠，降彥苗，耿玲玲，程汝宏，劉國慶

（河北省農林科學院谷子研究所，河北省雜糧重點實驗室，國家谷子改良中心，河北石家莊050035）

糜子雄性不育突變體的創制和遺傳分析

李海權，相金英，韓玉翠，降彥苗，耿玲玲，程汝宏*，劉國慶*

（河北省農林科學院谷子研究所，河北省雜糧重點實驗室，國家谷子改良中心，河北石家莊050035）

雜種優勢是培育高產、優質、高抗作物新品種的主要手段，而雄性不育系的選育直接決定著作物雜種優勢育種的成功。利用60Co-γ射線誘變首次創制出糜子（Panicum miliaceum，2n=4x=36）雄性不育突變體M207A，并對其進行了育性鑒定和初步的遺傳分析，目的是利用該突變體進行糜子雜交種的選育、在糜子中實現雜種優勢的利用。首先采用室內花粉鏡檢與田間調查相結合的方法對突變體進行了育性鑒定；將突變體與育性正常的糜子品種配組雜交獲得的F1和F2群體在不同地點、不同年份、不同季節種植，對不育突變體的遺傳模式進行了分析。結果表明：不育株花藥褐化，無外露，花藥干癟，不育度在95%以上，不育性狀穩定；利用育性正常的品種給穩定的突變體進行授粉，其結實率可達到正常水平；自交F2群體中育性分離比例為35∶1，符合單基因座位上同源四倍體基因的理論分離比，說明該突變性狀是由隱性單基因控制的可遺傳的“無花粉型”細胞核雄性不育。雄性不育突變材料M207A的創制，為糜子雜種優勢利用奠定了材料基礎。

糜子；輻射誘變；雄性不育突變體；遺傳分析；雜種優勢利用

植物雄性不育（plant male sterility）是植物在有性繁殖過程中由于生理或遺傳上的原因造成植物雌性器官正常而雄性器官不正常，不能產生花粉或花粉敗育而不能授粉結實的現象。雄性不育類型有很多種，依據不育基因的遺傳方式和在細胞中的定位可分為細胞核雄性不育和細胞質雄性不育2種。利用雄性不育進行雜交制種，是提高雜交制種效率、節約制種成本、保證制種質量的一條經濟且有效的途徑[1]。雄性不育材料是作物遺傳研究和育種利用的寶貴資源，是充分利用雜種優勢的材料基礎和前提，因此，雄性不育材料的發現與創制對于雜種優勢的成功利用和雄性不育的遺傳機理研究具有決定性的意義。前人在玉米[2～4]、水稻[5～8]和谷子[9～11]等多種作物中對雄性不育性狀開展了廣泛的研究和應用，但截至目前，在糜子（Panicum miliaceum，2n=4x=36）中還未見到雄性不育材料的報道，也未實現雜種優勢的利用。糜子起源于我國的黃河流域，迄今最早的人工栽培遺跡發現于河北省武安市的磁山文化遺址，已有10 300 a的歷史[12]。糜子是干旱半干旱地區的重要農作物，也是新墾土地的先鋒作物和理想的復種作物，具有豐富的營養價值，是重要的食療保健植物資源。我國是世界上糜子栽培面積最大的國家，長期以來，糜子作為重要的經濟和糧食作物主要分布在北方旱作區域，但由于產量不高、經濟效益一般，導致糜子種植面積日趨減少，目前我國的糜子年平均種植面積為73.33萬～80.00萬hm2[13]。另外，糜子品種改良技術落后，育種方法仍以系統選育和地方品種認定為主，盡管近年來開展了常規雜交育種工作，但是目前仍然存在品種單產水平較低、更新換代遲緩等問題。因此，進行育種方案調整，充分發掘雜種優勢潛力，加快新品種的選育進程成為當前糜子育種的關鍵性任務。

作者通過輻射誘變的方法首次在糜子中創制了雄性不育突變材料，并對其進行了初步的遺傳分析，可為利用雜種優勢加快糜子的品種改良、提高產量、促進糜子產業的快速提升發揮重要作用，也可為進一步探討作物雜種優勢機理提供材料基礎和契機。

1 材料與方法

1.1 雄性不育突變體的獲得

2009年選用糜子育成品種雁黍5號和張家口農家種二紫桿的育性種子，在河南省輻射加工工程研究中心進行不同劑量的60Co-γ射線輻射誘變。誘變種子在河北省農林科學院谷子研究所試驗站進行田間種植，獲得M1代單株并保存。2010年5月在河北省農林科學院谷子研究所試驗站（石家莊欒城）穗行種植M1代，成熟時調查育性突變情況，在M207家系中分離出不育株，單株收獲保存。2011年5月在河北省農林科學院谷子研究所試驗站（石家莊欒城）株行種植M2代，調查不育突變材料的穩定性及突變率，收獲單株；并于2011年冬季在海南省南紅農場實驗站和2012年春夏季在河北省農林科學院谷子研究所實驗站（石家莊欒城）溫室及大田連續套袋自交3代，繼續選擇自交可育株種植下一代，并調查不育突變材料的穩定性及突變率，將此過程中獲得的穩定不育材料稱為M207A。

1.2 田間試驗與性狀調查

2013～2014年連續2 a將M207A與糜子品種晉黍9號雜交配組，在河北省農林科學院谷子研究所試驗站（石家莊欒城）、張家口蔚縣和海南省南紅農場均種植親本以及F1和F2材料。田間種植30株/行，株行距10 cm×30 cm，其他田間管理措施同一般大田。自抽穗期開始，進行育性調查。成熟期，考查M207A及其野生型的主要農藝性狀，包括株高、劍葉長、劍葉寬、單株穗數、穗長、穗伸出度、每穗著粒數、結實率、千粒重等。

1.3 花粉育性鑒定

在糜子幼穗期，分別取M207A和雁黍5號尚未開花的小穗，在OLYMPUS SZX12顯微鏡下觀察花藥及柱頭的生長發育情況，在OLYMPUS BX61熒光顯微鏡下觀察花粉粒的發育情況；從每個穗子的中上部枝梗中選取當天將開的穎花3朵，用1%的KI-I2染液染色，在顯微鏡下觀察，根據花粉粒形態和染色狀況，分析可育和敗育的花粉及敗育類型。

2 結果與分析

2.1 M207A的育性鑒定

圖1 不育突變體材料M207A（A）與對照雁黍5號（B）的花藥比較Fig.1 Comparison of anthers from the sterile mutant M207A（A）and wild type Yanshu No.5（B）

M207A植株開花時，花藥小、不開裂，且花藥在開花前變黑，不伸出（圖1-A，封三）；而野生型雁黍5號的正常可育花藥呈黃色，開花時伸出穎殼，并包含有大量的花粉粒（圖1-B）。對二者的花粉采用碘染法染色后進行育性鏡檢發現，M207A花粉數量少，且活力低（圖2-A和B）；而雁黍5號正常花粉粒多且染色深，活力旺盛（圖2-C和D）。M207A田間套袋自交結實率平均為3.1%。同時，用晉黍9號、疙瘩黍等育性正常的品種給M207A授粉，其結實率可達到正常水平，說明不育突變材料的雌性花器正常。另一方面，分別在海南三亞和張家口蔚縣觀察不同播期M207A的小穗育性，結果顯示，該不育突變材料在不同光周期和溫度條件下均表現相似的不育性，說明M207A不育特性穩定，受光、溫等環境因素影響較小。

2.2 M207A的遺傳分析

M207A與晉黍9號雜交的F1植株表現完全可育，表明不育性狀受隱性基因控制。如果是受單基因控制，二倍體雜種的自交后代有3種基因型，顯隱性比例為3∶1。糜子是同源四倍體，在同一位點上有4個等位基因，它與育性正常糜子品種雜種后代的基因型種類和表現型比例要比二倍體復雜得多。以雙顯性AAaa為例，其自交后代有5種基因型，顯隱性比例將依染色體、染色單體隨機分離和完全均衡分離分別表現為35∶1、20.8∶1和19.3∶1這3種分離類型[14]。

統計F2群體中可育株與不育株的數量（表1），經χ2檢測，可育植株數與不育植株數符合35∶1的分離比例，表明M207A雄性不育性狀由單隱性核基因控制，且可育性狀對不育性狀表現為完全的顯性。

圖2 不育突變體材料M207A及野生型雁黍5號的花粉KI-I2染色結果Fig.2 Pollen staining with KI-I2solution from the sterile mutant M207A and wild type Yanshu No.5*A：M207A，20X；B：M207A，40X；C：雁黍5號，20X；D：雁黍5號，40X。

3 結論與討論

用輻射方法誘導突變是選育植物新種質快速、有效的方法之一，不僅可以快速創造新材料、新種質，而且不存在安全隱患[15]。研究表明，電離輻射可以誘導株高、生育期、抗性、葉型、育性及品質等性狀發生變異，結合育種目標進行鑒定和選擇，能達到創制新種質和輔助品種選育的目的[16～20]。60Co-γ射線是電離輻射中應用最多的射線，已成為傳統的創造新材料、新種質和誘變育種方法。本研究利用60Co-γ射線處理糜子品種雁黍5號的種子，在其誘變后代中經自交選育，創制出了糜子雄性不育的新種質M207A。該新種質在葉型、葉色、株高、莖粗、莖節數及單株穗數等營養生長方面并沒有出現明顯的變化，但在生殖生長時期花藥發育異常，外觀表現為花藥變小、褐化、不開裂且不伸出穎殼，碘染試驗發現花粉粒發育異常，成熟花粉數量少且活力低下，屬于敗育性花粉中較嚴重的碘敗型花粉。M207A的創制也證明了輻射誘變是拓展作物種質基礎的一條有效途徑。

表1 M207A與晉黍9號雜交后代F2群體的育性分離統計Table1 Fertility segregation statistics in the F2population from M207A/Jinshu No.9

雜種優勢是培育高產、優質、高抗作物新品種的主要手段，而利用雄性不育系進行雜交育種是雜種優勢利用的經濟、有效途徑之一；作為雜種優勢利用的關鍵步驟，雄性不育系的選育直接決定著作物雜種優勢育種的成功[21]。對新創制糜子不育材料M207A進行初步的遺傳分析，結果表明，控制其不育性狀的是單隱性基因，在該不育材料與育性正常品種晉黍9號雜交的F2群體中表現35∶1的分離比例。今后，還需要利用其F3及回交群體進行進一步的驗證。M207A不育度較高，但仍有3%～5%的自交結實率，因此，不需要尋找其保持系；且與育性正常糜子品種雜交，F1代育性正常，配組自由，易于選育出雜種優勢高的組合。但是該不育系也存在缺點，表現為在雜交制種時易出現不育株和可育株田間混雜，造成雜種不純等問題。因此，應用隱性核不育基因的關鍵是能夠有效區分不育株和可育株，傳統的鑒別方法包括形態標記鑒定如玉米和谷子上的黃白粒系統[22]和黃綠苗標記體系[9]及抗除草劑基因連鎖等[23，24]。近年來SPT（seed production technology）技術已成功地用于玉米雜交種的生產中，該技術利用現代生物技術，組合花粉失活基因、花粉育性恢復基因和紅色熒光蛋白標記基因，以此來構建遺傳轉化載體，并將其導入玉米隱性核雄性不育系中，通過機械色選技術將顏色不同的不育株和可育株種子分離開[25]。隨著分子生物學研究的不斷發展，結合不斷涌現的新方法和新技術，隱性核不育基因的應用前景將越來越廣闊。

生殖發育是植物發育中很重要的過程，涉及到花粉減數分裂、絨氈層降解、花粉壁形成、花藥開裂、花粉管伸長、雙受精等一系列的生物學過程。研究表明，造成雄性不育的核基因有很多，僅在水稻中就發現了控制雄性不育的核基因有18個，分別涉及到染色體聯會相關、絨氈層發育相關、花粉形成等發育相關等過程[5]；在其他不同的植物中，也發現了很多控制雄性不育的核基因[11]。新雄性不育基因的不斷發現，必將進一步提升我們對雄性不育的認識，也促進雄性不育系的培育和育種利用。同時，隨著分子生物學技術的進步和研究手段的不斷更新，對植物雄性不育機理的認識也變得更加全面和深刻[26～28]，如近年來隨著高通量測序技術的迅猛發展，通過轉錄組測序技術從RNA水平對植物雄性不育機制進行解析的研究報道逐漸增多，在水稻、小麥、玉米、棉花等20多個物種中，利用測序技術從轉錄水平分析了包括多種敗育類型的生殖發育及雄蕊敗育的機理，包括細胞核雄性不育（genic male sterility，GMS）[29，30]、細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）[31，32]、化學誘導雄性不育（induced male sterility）[33]、光敏雄性不育（photoperiod sensitive male sterility，PGMS）[34]和溫敏雄性不育（thermosensitive male sterility，TGMS）[35]等；利用二代測序技術，結合分子生物學與生物信息學分析測序數據，找出候選突變基因，大大縮短了基因克隆時間，降低了基因克隆成本，也實現了雄性不育基因的精細定位和克隆[36]。因此，充分利用組學技術獲得的大數據而提供的豐富信息將為進一步解析植物雄性不育機理提供強有力支持[37]。

糜子是主要的糧食作物之一，具有耐旱、耐瘠、耐鹽堿性強、成熟早等特點，且養分需求量低，籽粒養分合理，營養價值高，在我國的雜糧生產中占有重要地位[38]。但截至2010年，我國的糜子育成品種只有100多個，其中系統選育品種占到近半數，和地方品種認定一起，占到了63%[13]，說明我國糜子育種水平較低，在小麥、谷子、水稻中廣泛應用的雜交育種在糜子中應用得還不多，更談不上雜種優勢利用。M207A為糜子中首次創制的雄性不育材料，為今后培育糜子雜交種和雜種優勢利用奠定了堅實的遺傳基礎。

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The Creation and Genetic Analysis of a Male Sterility Mutant in Panicum miliaceum

LI Hai-quan，XIANG Jin-ying，HAN Yu-cui，JIANG Yan-miao，GENG Ling-ling，CHENG Ru-hong*，LIU Guo-qing*
（Institute of Millet Crops of Hebei Academy of Agricultural&Forestry Sciences，Key Laboratory of Minor Crops in Hebei，The National Foxtail Millet Improvement Center，Shijiazhuang 050035，China）

Heterosis plays an important role in development of new crop varieties with high-yielding，goodquality and biotic/abiotic stresses while male sterile line development is the key step to determine the success of heterosis utilization.A male sterile mutant，M207A was created in proso millet（Panicum miliaceum，2n=4x=36）for the first time using60Co-γ ray mutagenesis.Fertility identification and genetic analysis were carried out to characterize the mutant for its possible use for heterosis utilization in proso millet.First the sterility was investigated using both field survey and indoor pollen microscopy identification.Then Pollinated by normal fertile proso millet cultivars，F1and F2populations from the mutant were obtained.Meanwhile primary genetic analysis was also conducted using above populations in different experimental sites，seasons and years.The results showed that the male sterile plant exhibited closed glumes，browning and dry anthers with few normal pollens.The sterility was stable and sterility ratewas above 95%on average.The segregation ratio of fertile to sterile plants was 35∶1 in the fertile selfing F2population indicating that the mutant was a genic male sterility belonging to a pollen-less type controlled by a single recessive gene.The creation of the mutant，M207A can play a key role for heterosis utilization in proso millet.

Panicum miliaceum；Radiation mutagenesis；Male sterile mutant；Genetic analysis；Hoterosis utilization

S516

：A

：1008-1631（2016）06-0001-05

2016-07-10

國家科技支撐計劃項目（2014BAD07B03）；河北省財政專項（2016023668）

李海權（1977-），男，河北樂亭人，副研究員，碩士，主要從事植物分子遺傳育種研究。Tel：0311-87670695；E-mail：lihaiquan77@aliyun.com。

程汝宏（1963-），男，河北盧龍人，研究員，碩士，主要從事谷子、糜子遺傳育種研究。Tel：0311-87670697；E-mail：rhcheng63@126.com。

通訊作者：劉國慶（1964-），男，河北滄州人，研究員，博士，主要從事植物分子遺傳育種研究。Tel：0311-87670695；E-mail：guoqingliu@hotmail.com。