甲醛固定與微波固定在消化道內分泌細胞免疫組織化學染色中的比較

李明華　史鵬飛

?

甲醛固定與微波固定在消化道內分泌細胞免疫組織化學染色中的比較

李明華1史鵬飛2

【摘要】目的 探討微波固定在消化道內分泌細胞免疫組化染色中的方法。方法 應用不同強度的微波輻射與常規福爾馬林方法固定組織，并用石蠟切片免疫組化染色觀察。結果 常規福爾馬林固定經抗原修復后，經染色內分泌細胞呈棕黃色，不經抗原修復內分泌細胞能著色，用微波輻射低檔達45℃、55℃、70℃固定的組織都能被著色。結論 微波固定組織切片染色效果優于常規福爾馬林固定組織，縮短固定時間，微波固定的材料能很好的保存抗原。

【關鍵詞】微波；石蠟切片；消化道；內分泌細胞

作者單位：1 462000漯河醫學高等專科學校基礎醫學部；2 462000漯河市中心醫院創傷骨科

微波輻射能使液體中極性分子高頻振動，增加液體分子間的摩擦和碰撞，加快液體內部迅速產熱和某些化學反應。許多學者利用此原理進行了微波輻射固定組織的實驗[1-4]，均取得良好的效果。但微波輻射固定某些特定組織在免疫組化染色中的具體方法報道較少，為了拓展微波在組織切片中的應用，探討微波輻射固定胃腸內分泌細胞在免疫組化中的具體方法，比較甲醛與微波固定的不同。微波固定比常規固定時間短，提高了免疫組織化學對基礎、預防、臨床和軍事醫學的研究都有重要的價值，具體報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與主要儀器

對照組1～4為蟾蜍胃，對照組5～8為蟾蜍小腸，實驗組1～6為蟾蜍胃，輻射儀器為海爾牌H-R 7 751 MS型家用微波爐（750 W，分6檔），0.01 mol/LPBS液（pH 7.4），0.01 mol/L，pH 6.0檸檬酸緩沖液（CB），羊血清和二抗Maixin試劑（北京博奧森生物技術有限公司），一抗（胃泌素，福州邁新生物技術開發有限公司；5-HT，博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（試劑A濃縮緩沖液，試劑B濃縮DAB溶液，試劑C濃縮過氧化氫溶液）。

1.2固定方法

將材料分成14個組，8個對照組用常規福爾馬林固定，6個實驗組用微波輻射，先用生理鹽水進行測試，找出符合實驗設計的微波輻射檔次和恰當的輻射時間。微波輻射方法：將實驗組1～6材料放于小白廣口瓶（容量60 ml）內加20 ml生理鹽水，而后放在內盛400 ml水的玻璃器皿上方并一同放入微波爐內，實驗1、2組，水+微波達45℃，實驗3、4組，水＋微波達55℃，實驗5、6組，水+微波達70℃。

2　結果

2.1對照組

組織結構與透明：胃腸壁組織結構完整，透明度良好，各類細胞均有一定程度的收縮。結締組織內常有較大的空隙，腺管腔擴大，腸黏膜上皮間有一定裂隙。組織著色：對照組的內分泌細胞經免疫組化染色呈棕黃色，結締組織與其他的結構不著色。對照組1、3、5、7比對照組2、4、6、8效果更明顯。

2.2實驗組

實驗組3、4組織結構與透明：胃壁組織無損傷，基本透明，細胞無收縮，胞質均勻，胞間隙與各腺管腔正常，胞間隙清晰，內分泌細胞正常，透明清晰。組織著色：內分泌細胞著色比對照組著色深，其他細胞不著色。從整體效果看，組織完整性好，細胞形態好，內分泌細胞著色深，效果優于對照組。實驗組5、6組織透明性好，胃壁黏膜表層有損傷，細胞膨脹，免疫組化染色內分泌細胞著色。結締組織與其他組織不著色。實驗組1、2胃壁黏膜多與其他層次脫離，內分泌細胞也可染色，透明較差。

3　討論

通過以上實驗組5、6提示胃黏膜淺層損傷，結締組織損傷和內分泌細胞膨脹可能是微波輻射過量所致。實驗組1、2提示胃黏膜與其他組織脫離，組織透明不良，可能是組織固定不夠所致。實驗組3、4組織結構完整性與染色均良好，提示單獨微波輻射能良好的固定內分泌細胞，微波達55℃是理想的微波輻射量。組織完整性好，透明好，細胞無損傷，無收縮，胞質均勻，經免疫組化染色鮮明。常規福爾馬林固定使細胞有一定的收縮，能使內分泌細胞著色，而微波輻射固定既能保持細胞正常的形態和結構，經免疫組化染色又能使內分泌細胞著色。說明微波輻射既能良好的固定內分泌細胞，又能很好的保護組織細胞的形態和結構。

由于當前對甲醛固定組織所發生的反應，尤其對蛋白質的立體構象會發生的影響尚不十分清楚，導致對抗原修復的機制也不很清楚。可能的機制主要是：（1）由于甲醛固定可使蛋白與甲醛、蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間通過甲基化橋形成交聯，抗原決定簇被遮蔽，可通過高溫、鹽緩沖液使交聯的蛋白水解，斷開交聯[5]。（2）組織用甲醛固定時，會形成蛋白-甲醛-鈣復合體，并遮蔽了抗原決定簇，可通過高溫使鈣離子釋放，并與修復液中的螯合物-檸檬酸結合，暴露抗原決定簇[5]。（3）還有觀點認為[5]，經甲醛固定后，可形成甲醛化蛋白的三維空間，加熱后可恢復蛋白質自然的三維空間，使抗原得以修復。甲醛固定使抗原決定簇遮蔽，微波固定，不存在抗原決定簇遮蔽。

綜上所述，材料經微波輻射后經免疫組化染色整體效果優于對照組，這些方法不僅縮短了制片時間，而且在臨床疾病研究有了重大的突破。更重要的是還在理論上提示經抗原修復與不經修復都著色，微波處理也著色。

參考文獻

[1] Hafajee ZA， Leong AS. Ultra-rapid microwave-stimulated tissue processing with amodified protocol incorporating microwave fixation[J]. Pathology， 2004，36（4）：325-329.

[2] 李映菊，謝艷紅，馬林. 微波照射在心肌石蠟切片特染中的應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志，1998，14（3）：305.

[3] 楚德昌. 微波在Cajal染色中的應用[J]. 生物學雜志，2003，20（2）：35-36.

[4] 唐巖，唐軍民. 結合微波技術顯示胃腸嗜銀細胞[J]. 中國組織化學與細胞化學雜志，2002，11（4）：502.

[5] 倪燦榮，馬大列，戴益民. 免疫組織化學實驗技術及應用[M].北京：化學工業出版社，2006：6.

Comparison the Formaldehyde Fixed and Microwave Fixed in Gastrointestinal Endocrine Cells of Immunohistochemistry

LI Minghua1SHI Pengfei21 Faculty of Basic Medicine, Luohe Medical Junior College, Luohe 462000, China. 2 Traumatic Orthopedics Department, Luohe City Central Hospital, Luohe 462000, China

[Abstract]Objective To explore the formaldehyde fixed and microwave fixed gastrointestinal endocrine cells in the immune group. Methods Different intensity of microwave radiation and conventional method of formalin fixed, and paraffin sections immunohistochemical staining observed. Results Formalin fixed by conventional antigen restored, the endocrine cells were stained brown, without antigen endocrine cells can not stained,with microwave radiation of low-grade 45℃, 55℃, 70℃ fixed tissue can be contracted. Conclusion The staining effects of the paraffin section prevail over the paraffin section from routine formalin fixated specimens. The method above make the time of fixating tissue shorten, microwave fixed material could save antigen better.

[Key words]Microwave, Paraffin sections, Digestive tract, Endocrine cell

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.02.083

【文章編號】1674-9308（2016）02-0116-02

【中圖分類號】R364.7

【文獻標識碼】A