超聲微泡破裂法促進骨形態發生蛋白-2在大鼠骨髓間充質干細胞表達的研究

劉永恒　王東　李巖　段志青　郭麗

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超聲微泡破裂法促進骨形態發生蛋白-2在大鼠骨髓間充質干細胞表達的研究

劉永恒1王東2李巖1段志青3郭麗3

【摘要】目的 探討超聲微泡破裂法對基因重組人骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）質粒GV 147-rhBMP 2-GFP在大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的轉染、表達的促進作用。方法 選取8周齡Sprague-Dawley雄性大鼠分離培養BMSCs，傳至第3代時胞懸液分為3組：A組（單純細胞組），B組（質粒組，僅加質粒GV 147-rhBMP 2-GFP）及C組（超聲+微泡+質粒組）；轉染后48h用倒置熒光顯微鏡觀察質粒轉染情況及細胞生長狀況，RT-PCR檢測細胞轉染后的目的基因表達。對數據進行分析。結果 48h后可在倒置熒光顯微鏡下，觀察到質粒組及超聲+微泡+質粒組部分細胞胞漿內發出綠色熒光，其中單純細胞組未見綠色熒光，超聲+微泡+質粒組的綠色熒光表達量高于B組；RT-PCR檢測顯示C組BMP-2基因mRNA相對表達量較B組高。結論 超聲微泡破裂法能增加外源性rhBMP-2基因在大鼠骨髓間充質干細胞轉染率和表達水平，有望為骨折的基因治療提供一種新型方法。【關鍵詞】超聲；微泡；基因治療；人骨形態發生蛋白-2；骨髓間充質干細胞

作者單位：1 030001太原，山西醫科大學；2 030001太原，山西醫科大學第二醫院骨科；3 030001太原，山西醫科大學第二醫院骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室

骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）屬于β轉化生長因子超家族成員，骨生長的啟動因子，其中BMP-2是最主要的骨形成調節因子［1-2］。含BMP-2基因的質粒轉染骨髓間充質干細胞BMSCs的轉染率較低。超聲微泡破裂法在基因治療領域有較高應用價值，可以安全有效地促進目的基因轉移，提高外源基因轉染率和表達水平［3］。本實驗在超聲微泡破裂法作用下，將重組人骨形態發生蛋白-2（Recombinant Human Bone Morphogenic Protein-2，rhBMP-2）基因，通過質粒轉染大鼠骨髓間充質干細胞BMSCs，觀察其對大鼠BMSCs表達的影響。

1　實驗材料與方法

1.1實驗材料

（1）實驗動物：8周齡健康Sprague-Dawley 大鼠3只，體重約180g，雄性（山西醫科大學實驗動物中心提供）。（2）質粒構建：攜帶重組人骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）和綠色熒光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP） 基因的質粒GV 147-rhBMP 2-GFP（上海吉凱公司協助構建）。（3）主要試劑：Promega Go Taq?qPCR Master Mix，（A 6 001）200 Reactions（普洛麥格公司，美國）；Promega，Go ScriptTMReverse Transcription System，Promega A 5 000，50 reactions（普洛麥格公司，美國）；注射用六氟化硫微泡（聲諾維）（瑞士Bracco Suisse SA上海博萊科信誼藥業有限責任公司分裝）；RT-PCR引物（英濰捷基上海貿易有限公司）。（4）主要儀器與設備：超聲治療儀（Mark 3，EMS Limited，Oxford）；倒置相差顯微鏡（U-LH00HG，Olympus 公司產品，德國）；Bio-Rad C 1 000 Thermal Cycler（北京友華照欽醫療器械有限公司）；Bio-Rad IQ 5 Multicolor Real-Time PCR（北京友華照欽醫療器械有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1Sprague-Dawley大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的分離、培養 大鼠麻醉后處死，用75%酒精浸泡約10min，在無菌條件下取出股骨和脛骨，去除骨表面的軟組織。用咬骨鉗將兩端干骺端切除，顯露骨髓腔。用5ml注射器吸取DME/F-12徹底沖洗骨髓腔至白色，過濾后收集沖洗液。應用密度梯度離心和貼壁法分離目的細胞：骨髓懸液在室溫下，以1 100 r/min離心3～4min；離心后去上清，用15%無噬菌體、低內毒素胎牛血清的DME/F-12完全培養液重懸，制成單細胞懸液，于37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及其生長情況。此時細為原代細胞，當80%～90% 細胞融合時，傳代培養，此時細胞為第1代。待細胞80%～90%融合后，重復上述步驟進行傳代，細胞培養至第3代。

1.2.2實驗分組（每組10孔）（1）A組：細胞未作任何處理。（2）B組：每孔加入6μg重組質粒，500μl不含血清培養基，室溫孵育20min。（3）C組：質粒+微泡造影劑+超聲輻照組，每孔加入6μg重組質粒，500μl濃度為10%的微泡造影劑，室溫孵育20min，超聲輻照條件同前。取第3代細胞，以轉染倍數（MOI=25）行質粒轉染，500μl 濃度為 10%微泡造影劑（含DME/F-12，不含血清），超聲（頻率2.0 MHz，機械指數0.28，時間30s），6h后每孔后加入換體積分數為15%胎牛血清的DME/F-12完全培養液，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中繼續培養，倒置熒光顯微鏡下觀察質粒轉染情況及細胞生長狀況。

1.2.3RT-PCR技術檢測rhBMP-2基因mRNA表達 參照Gene Bank中基因的核酸序列進行引物設計。rhBMP-2引物序列：5’-ACCCGCTGTCTTCTAGCGT-3’（上游），5’-TTTC AGGCCGAACATGCTGAG-3’（下游）；GAPDH引物序列：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’（上游），5’-GCCATCA CGCCACAGTTTC-3’（下游）。Trizol法提取細胞總RNA。使用RNA分光光度計測RNA濃度并據此配平RNA量，按照Promega公司的反轉錄試劑盒說明書設置反轉錄條件并進行反轉錄。反轉錄完成后，取cDNA產物做模板，按試劑盒說明書配成每孔20μL的反應體系，啟動Bio-Rad IQ 5 Multicolor Real-Time PCR相應程序并運行。

1.3統計學方法

所得數據使用SPSS13.0統計學軟件進行處理分析，計量資料以（均數±標準差）表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05，差異具有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的形態學觀察

剛接種時，細胞呈圓形，大部分懸浮于培養液中。12h開始貼壁，細胞呈圓形或橢圓形。48h后，大部分細胞貼壁，形態不一，呈梭形或多角形改變。第3d，細胞增殖，數量增多，出現散在的貼壁生長的成纖維樣細胞。第5～7d，細胞數量增多，呈單層生長，細胞形態趨于一致，呈梭形。傳代細胞24h內完全貼壁。第3代細胞呈均勻一致的梭形。

2.2基因表達檢測

（1）熒光顯微鏡觀察轉染結果48h后可見A組無綠色免疫熒光，B組和C組有綠色熒光，C組多于B組，綠色熒光分布于整個骨髓間充質干細胞，呈胞質分布，說明質粒轉染成功，重組質粒轉染的rhBMP-2基因在大鼠骨髓間充質干細胞中成功表達。（2）RT-PCR 檢測結果rhBMP-2基因mRNA相對表達量，超聲+微泡+質粒組較質粒組組高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3　討論

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。其具有多向分化潛能，可以分化為為：成肌細胞、脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞［4］。體內和體外實驗證實，骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）既可以促進成骨祖細胞分化為成骨細胞，又可以促進來自外周血的間充質干細胞分化為成骨細胞；同時動物體內實驗驗證［5］，骨形態發生蛋白對骨形成有促進作用。有促進成骨作用的骨形態發生蛋白是骨組織工程的重要成員［6-7］。其中rhBMP-2在臨床骨科創傷的治療中有重要作用，例如脛骨骨折、骨缺損、骨不連的治療［8］。

多種方法可以將目的基因導入宿主，直接注射裸質粒是其中一種重要的方法，被應用于基因治療。目前，如何提高低效的質粒轉染是基因治療的重要研究方向。最新研究發現一種有望成為其突破點的方法，可以提高目的基因轉染率和表達水平的方法，用特定條件超聲輻射，可作為體內基因轉染載體的超聲微泡造影劑，對目的基因轉染有促進作用［9-10］。超聲微泡破裂法的作用機制：微泡造影劑經特定條件的超聲輻射可以產生“空化效應”，重復壓縮膨脹的循環過程，同時微泡造影劑經還能減小超聲輻射的空化閾值，加強其空化效應；一定強度的超聲輻射可使微泡破損，促進基因從微泡中釋放，細胞膜在超聲輻射作用下有孔洞形成，有利于外源基因進入細胞［11-12］；研究證明［13-14］，超聲微泡破裂法及其產生的微射流可以促進基因釋放，從而為基因轉染創造條件。

本實驗課題是在超聲微泡破裂法作用下將重組質粒GV 147-rhBMP 2-GFP轉染大鼠骨髓間充質干細胞，觀察質粒轉染情況及其所含目的基因BMP-2的表達情況，為超聲微泡破裂法應用于骨折的基因治療奠定基礎。本實驗研究發現，重組質粒轉染后48h，單純重組質粒組和超聲+微泡+質粒組均可在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，但后者多于前者，證實質粒轉染成功；RT-PCR檢測結果顯示，BMP-2基因mRNA的相對表達量在超聲+微泡+質粒組多于單純質粒組（P＜0.05），證明超聲微泡破裂法能提高外源性rhBMP-2基因在大鼠骨髓間充質干細胞轉染率和表達水平，有望為骨折的基因治療提供一種新型方法。但由于實驗條件限制，本實驗僅在基因水平進行研究，后續實驗需要在蛋白表達水平進行研究。

參考文獻

［1］鄭軍，齊新生.骨形態發生蛋白在骨缺損和壞死修復中的成骨機制和運用［J］.中國矯形外科雜志，2004，12（23、24）：1888-1890.

［2］馬文輝，時述山，李亞非.骨修復中骨形態發生蛋白（BMP）成骨機理的研究及其應用現狀［J］.中國矯形外科雜志，2001，8（2）：167-170.

［3］Nishida K，Doita M，Takada T，et al.Sustained transgene expression in intervertebral disc cells in vivo mediated by microbubble-enhanced ultrasound gene therapy［J］.Spine，2006，31（13）：1415-1419.

［4］Peister A，Mellad JA，Larson BL，et al.Adult stem cells from bone marrow（MSCs） isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes，rates of proliferation，and differentiation potential［J］.Blood，2004，103（5）：1662-1668.

［5］康夏，權毅，董世武.BMPs及其相關microRNAs在MSC向成骨細胞分化過程中的作用［J］.中國骨質疏松雜志，2012，18（9）：846-849.

［6］Bramono DS，Murali S，Rai B，et al.Bone marrow-derived heparin sulfate potentiates the osteogenic activity of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）［J］.Bone，2012，50（4）：954-964.

［7］Rui YF，Lui PP，Lee YW，et al.Higher BMP receptor expression andBMP-2-induced osteogenic differentiation in tendon-derived stem cells compared with bone-marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Int Orthop，2012，36（5）：1099-1107.

［8］張攀，白鈺，李云裳，等.BMP-2在骨組織再生和修復上的作用研究進展［J］.中國實用醫藥，2011，6（20）：226-227.

［9］Guo H，Leung JC，Chan LY，et al.Ultrasound-contrast agent mediated naked gene delivery in the peritoneal cavity of adult rat［J］.Gene Ther，2007，14（24）：1712-1720.

［10］Chen S，Ding JH，Bekeredjian R，et al.Efficient gene delivery to pancreatic islets with ultrasonic microbubble destruction technology［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（22）：8469-8474.

［11］Newman CM，Bettinger T.Gene therapy progress and prospects：Ultrasound for gene transfer［J］.Gene Ther，2007，14（6）：465-475.

［12］Dijkmans PA，Juffermans LJ，Musters RJ，et al.Microbubbles and ultrasound：From diagnosis to therapy［J］.Eur J Echocardiogr，2004，5（4）：245-256.

［13］Laing ST，Mepherson DD.Cardiovascular therapeutic uses of targeted ultrasound contrast agents［J］.Eur Soc Cardiol，2009，83（4）：626-635.

［14］Bhatia VK，Senior R.Contrast echocardiography：evidence for clinicaI use［J］.J Am Soc Echocardiogr，2008，21（5）：409-416.

Ultrasound-Mediated Microbubble Destruction Enhances Bone Morphogenetic Protein-2 Gene Expression in the Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

LIU Yongheng1WANG Dong2LI Yan1DUAN Zhiqing3GUO Li3，1 Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.2 Department of Orthopaedics，The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.3 The Key Laboratory in Shanxi Provincial for Bone And Soft Tissue Injury Reapir，The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

［Abstract］Objective To explore whether ultrasound-mediated microbubble destruction can enhance the expression of plasmid-GV147-rhBMP2-GFP for recombinant human bone morphogenic protein-2（rhBMP-2） in the rat bone marrow mesenchymal stem cells.Methods BMSCs of 8-week old male Sprague-Dawley rats were separated and cultured.In the 3rd passage，ells were divided into three groups：group A was without any treatment ，group B was given GV147-rhBMP2-GFP plasmid and ultrasound，group C was given GV147-rhBMP2-GFP plasmid and microbubbles plus ultrasonic irradiation.Forty-eight hours after transfection，the transient expression situation and the growth condition of cells was observed under inverted fluorescence microscopy.RT-PCR analysis was taken to evaluate the mRNA expression of BMP-2.Results Green fluorescence was observed in group B and C by fluorescence microscopy，which was negative in group A.The green fluorescence of group C was more than that of group B.RT-PCR assay showed that the mRNA expression of BMP-2 in group C was more than that in group B.Conclusion Ultrasound-mediated microbubble destruction could enhance the transfection and expression efficiency of rhBMP-2 gene in the rat bone marrow mesenchymal stem cells.It is a new gene therapy method for bone fracture.

［Key words］Ultrasound，Microbubble，Gene therapy，Human bone morphogenetic protein-2，Bone mesenchymal stem cells

【中圖分類號】R-331

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）08-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.08.019