miRNA-152表達與NSCLC對順鉑耐藥的關系及其機制研究

郭 迪，李宏云△，楊 華

(鄭州大學第五附屬醫院:1.呼吸內科;2.普通外科，鄭州 450052)

miRNA-152表達與NSCLC對順鉑耐藥的關系及其機制研究

郭 迪1，李宏云1△，楊 華2

(鄭州大學第五附屬醫院:1.呼吸內科;2.普通外科，鄭州 450052)

目的 研究微小RNA-152(miRNA-152)在非小細胞肺癌(NSCLC)順鉑(DDP)耐藥過程中的作用機制。方法 實時熒光定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)檢測NSCLC細胞株A549及其DDP耐藥株A549/DDP細胞內的miRNA-152水平。通過轉染miRNA-52模擬物(miRNA-152 mimic)以提高A549/DDP細胞內的microRNA-152水平。MTT試驗、倒置相差顯微鏡技儀和流式細胞術觀察上調miRNA-152對細胞增殖及凋亡的影響，同時采用qRT-PCR和Western blot技術觀察細胞內Bcl-2及核轉錄因子-κB(NF-κB)水平變化。結果 A549/DDP細胞中存在miRNA-152的低表達，Bcl-2及NF-κB的高表達。上調miRNA-152后，DDP造成的A549/DDP細胞增殖抑制率和凋亡率顯著高于未上調miRNA-152的細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。此外，miRNA-152 mimic轉染可顯著降低A549/DDP細胞中的Bcl-2及NF-κB表達。結論 低miRNA-152表達可能引起NSCLC對DDP的耐藥，miRNA-152可能通過調節Bcl-2及NF-κB的水平介導NSCLC細胞對順鉑的敏感性。

癌,非小細胞肺；微小RNAs；Bcl-2；核因子κB；順鉑；藥物耐受性

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的生長分裂較慢，擴散轉移較晚，因此大部分患者在首診時已經進入進展期，喪失了手術根治的時機。這種情況下，NSCLC的非手術治療就成為了治療的重要環節[1]。非手術治療主要包括靶向治療和化學治療，對于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變陽性的NSCLC患者來說，首選方案為EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)靶向治療，如使用吉非替尼等藥物。而對于EGFR突變陰性的NSCLC患者EGFR-TKI的使用效果有限，因此這類患者首選化學治療[2-3]。化學治療方案中，以鉑類藥物為基礎的聯合化學治療應用廣泛，如順鉑(cisplatin，DDP)方案的效果已經得到臨床證實。但是NSCLC患者對鉑類藥物的耐藥現象同樣不容忽視，進一步探索NSCLC患者對鉑類藥物耐藥的機制具有重要意義[4]。近年來微小RNA(microRNA,miRNA)的轉錄后調控作用備受矚目，大量研究發現miRNA的表達變化與腫瘤的發生、發展及耐藥機制有關。研究證實NSCLC患者存在miRNA-152的低表達[5]，但關于miRNA-152表達與NSCLC對鉑類藥物耐藥之間的關系還鮮有研究。因此，本研究探討耐藥的A549細胞中miRNA-152表達變化，觀察其對DDP敏感性的影響，并初步闡述其介導耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 人肺腺癌A549細胞株購自上海中科院細胞庫，DDP耐藥A549/DDP細胞株購自上海斯信生物科技有限公司。胎牛血清和DMEM培養基購自美國Gibco公司。miRNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。ImProm-ⅡTM逆轉錄試劑盒、GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司。Trizol試劑及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。CCK-8試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司。ECL發光試劑盒購自北京普利來生物科技有限公司。鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人NF-κB抗體、鼠抗人GAPDH抗體、二抗購自英國Abcam公司。miRNA-152模擬物購自上海吉瑪公司。

1.2 細胞培養 A549細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基。A549/DDP細胞株培養于含12%胎牛血清的DMEM培養基，正常傳代3次后，須向培養基加入DDP，并維持DDP水平為2 μg/mL以保持其耐藥性。培養環境均為5% CO2，37 ℃。A549/DDP細胞的耐藥性已經在預試驗中得到驗證，耐藥指數約為4.51。

1.3 實時熒光定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)檢測miRNA-152 使用miRNA 快速提取試劑盒提取并純化A549細胞及A549/DPP細胞中的miRNA。使用ImProm-ⅡTM逆轉試劑盒將提取的miRNA轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系和條件嚴格參照廠商提供的說明書。miR-152正向引物序列為5′-GAG TGC TCA GTG CAT GAC AG-3′，反向引物序列為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。采用U6 RNA作為內參，其正向引物序列為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，反向引物序列為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以2-ΔΔCt法計算miRNA-152的相對表達情況。其中ΔCt=Ct目標-Ct內參。

1.4 qRT-PCR檢測Bcl-2 mRNA和NF-κB mRNA 使用Trizol試劑提取A549細胞及A549/DPP細胞中的總RNA。ImProm-ⅡTM逆轉錄試劑盒對提取出的總RNA進行逆轉錄，以合成cDNA。逆轉錄體系參照試劑盒提供的說明書。使用GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒對上述合成的cDNA進行PCR擴增。Bcl-2的正向引物為5′-TTC TTT GAG TTC GGT GGG GTC-3′，反向引物為5′-TGC ATA TTT GTT TGG GGC AGG-3′；NF-κB的正向引物為5′-CTG CAT TTC CAC AGT TTC CAG AACC-3′，反向引物為5′-ACG CTG CTC TTC TAT AGG AAC TTG G-3′；內參GAPDH的正向引物為5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，反向引物為5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。反應體系和方案參照試劑盒說明書。使用2-△△CT法分析目的mRNA的相對表達情況。

1.5 Western blot法檢測Bcl-2和NF-κB 提取A549細胞及A549/DPP細胞中的總蛋白，使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，并轉膜。轉膜結束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用1∶1 500的鼠抗人Bcl-2抗體，1∶2 000的鼠抗人NF-κB抗體及鼠抗人GAPDH抗體，4 ℃孵育12 h。接著使用磷酸鹽緩沖液-Tween 20(PBST)洗滌3次，除去未結合的一抗。二抗稀釋后(1∶1 000)與膜接觸，室溫下孵育1～2 h，ECL發光試劑盒顯色并分析條帶。

1.6 miRNA-152的過表達 轉染前將A549/DDP細胞轉移至不含DDP的培養基中常規培養，待細胞貼壁后，消化細胞制備細胞懸液，以6 000/孔的細胞密度將細胞接種于96孔板，當細胞匯合度達到80%左右時，使用LipofectamineTM2000轉染試劑盒將miRNA-152模擬物(miRNA-152 mimic)轉入細胞，miRNA-152 mimic的工作水平為50 nmol/L，相同方法轉染無關miRNA mimic作為陰性對照。繼續培養48 h，qRT-PCR驗證轉染效果。

1.7 CCK-8試驗及形態學檢查分析miRNA-152上調對細胞抑制率的影響 將A549/DDP細胞分為5組：未經DDP處理且未任何轉染處理的A549/DDP細胞(A組)，未經DDP處理，但經無關miRNA mimic轉染處理的A549/DDP細胞(B組)，未經DDP處理，但經miRNA-152 mimic轉染處理的A549/DDP細胞(C組)，經3 μmol/L DDP處理，但未經任何轉染處理的A549/DDP細胞(D組)，經3 μmol/L DDP處理且經無關miRNA mimic轉染處理的A549/DDP細胞(E組)，經3 μmol/L DDP處理且經miRNA-152 mimic轉染處理的A549/DDP細胞(F組)。處理24 h后，MTT法計算各組抑制率。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的增殖情況。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 細胞分組同上，各組處理時間達到后，常規收集細胞，使用Annexin V-FITC試劑盒內的緩沖液重新懸浮細胞。依此加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混勻后室溫避光孵育15 min上機檢測。

1.9 qRT-PCR及Western blot分析miRNA-152過表達對細胞Bcl-2及NF-κB表達的影響 培養未經轉染的A549/DDP細胞(空白對照組)，轉染miRNA-152 mimic 的A549/DDP細胞(試驗組)，以及轉染無關miRNA mimic的A549/DDP細胞(陰性對照組)48 h。按上文所述方法提取3種細胞中的總RNA及總蛋白樣本。qRT-PCR及Western blot分析方法同上，相關引物和抗體均同前，檢測miRNA-152上調后A549/DDP細胞中Bcl-2及NF-κB的表達變化。

2 結 果

2.1 A549/DDP細胞的miRNA-152表達 與A549細胞相比，A549/DDP細胞miRNA-152表達較低，相對降低的倍數為(0.65±0.04)倍，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 A549及A549/DDP細胞中的miRNA-152相對表達水平

2.2 A549/DDP細胞的Bcl-2及NF-κB表達 與A549細胞相比，A549/DDP細胞Bcl-2及NF-κB mRNA 表達水平較高，分別相對提高了(1.53±0.21)倍和(1.37±0.13)倍，差異有統計學意義(P<0.05)。Western blot分析證實，Bcl-2及NF-κB蛋白表達同樣在A549/DDP細胞中較高，見圖2、3。

A：Bcl-2；B:NF-κB。

圖2 A549及A549/DDP細胞中的Bcl-2、NF-κB mRNA相對表達水平

圖3 A549及A549/DDP細胞中的Bcl-2及NF-κB蛋白表達水平

2.3 miRNA-152表達上調增加A549/DDP細胞對DDP的敏感性 如圖4所示，B、C、D、E、F組的細胞增殖抑制率分別為(7.5±2.5)、(6.8±2.1)、(22.6±3.8)、(23.4±3.4)、(41.3±4.4)%。其中F組細胞抑制率顯著高于D組和E組，差異有統計學意義(P<0.05)。形態學結果顯示，DDP能夠抑制細胞增殖且F組細胞增殖顯著低于D組，見圖5。

圖4 3 μmol/L DDP處理 A549/DDP細胞24 h后的細胞抑制率

圖5 各組細胞倒置相差顯微鏡圖像(×200)

A:流式細胞分析圖；B：凋亡分析圖。

圖6 3 μmol/L DDP處理 A549/DDP細胞24 h后的流式細胞分析圖和凋亡分析圖

2.4 miRNA-152表達上調增加DDP引起的A549/DDP細胞凋亡 如圖6所示，A、B、C、D、E、F組的細胞凋亡率分別為(3.8±1.3)、(4.4±0.9)、(4.8±1.1)、(14.5±2.2)、(13.2±1.9)、(22.3±2.1)%。其中F組細胞凋亡率顯著高于D組和E組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 miRNA-152表達上調可以降低A549/DDP細胞中Bcl-2及NF-κB的表達 qRT-PCR發現，試驗組Bcl-2及NF-κB mRNA 水平較空白對照組及陰性對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。Western blot結果顯示，試驗組Bcl-2及NF-κB 蛋白水平也顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。圖7、8。

A：Bcl-2;B：NF-κB。

圖7 miRNA-152 mimic 轉染對A549/DDP細胞中Bcl-2、NF-κB mRNA水平的影響

圖8 miRNA-152 mimic 轉染對A549/DDP細胞中Bcl-2和NF-κB mRNA水平的影響

3 討 論

DDP的耐藥機制較為復雜，主要涉及藥物轉運、藥物解毒、細胞凋亡等多個方面，常見的機制有如下幾個方面：(1)細胞膜上的分子泵表達異常，大量藥物排出細胞外，導致細胞內的藥物水平降低，如人類多藥耐藥基因編碼的P-gp過表達引起的耐藥，P-gp由人類多藥耐藥基因(mul-tidrug resistance gene，MDR)家族中的mdr1編碼產生，定位于細胞膜，是一種能量依賴性的分子泵，它能將DDP或其他化學治療藥物泵出細胞外，導致腫瘤細胞內的藥物水平降低或者藥物重分布[6]。(2)細胞的藥物解毒效應增強，也導致藥物代謝、排除增加或者藥物毒性減少，如谷胱甘肽轉硫酶π家族的表達異常引起的耐藥，谷胱甘肽轉硫酶π可增加藥物極性、清除藥物的代謝產物、阻止藥物與腫瘤細胞的DNA結合及催化谷胱甘肽與親電子物質結合、消除化學治療藥物產生的活性氧損傷，避免細胞膜上的脂質氧化[7]。(3)DNA的修復功能異常，如拓撲異構酶Ⅱ的突變會造成DDP耐藥。(4)凋亡調控蛋白的異常，DDP可能通過一些凋亡調控因子促進細胞凋亡，這些調控因子異常時，可能造成DDP的療效降低[8]。

很多關于腫瘤的研究開始關注miRNA與腫瘤發生發展及耐藥現象的關系。miRNA是一類長約21～25 nt的非編碼小分子RNA，其在轉錄后水平上抑制靶基因的表達，從而調控細胞的增殖、凋亡等生命現象。越來越多的研究證實，miRNA與腫瘤關系密切，影響腫瘤的進展、分化、轉移甚至耐藥等[9]。特別是耐藥是臨床上腫瘤內科治療亟待解決的瓶頸問題，尋找可以用于逆轉耐藥的潛在的miRNA靶點引起人們廣泛的興趣。有研究表明，乳腺癌的阿霉素耐藥株MCF-7/ADR與非耐藥株相比，存在36個miRNA的表達差異[10]。還有研究發現，miR-17～92基因簇與卵巢漿液性癌化學治療耐藥有關，可用于化學治療效果的評估[11]。本研究發現與非耐藥的A549細胞相比，對DDP耐藥的A549/DDP細胞存在miR-152的低表達，因此，作者認為較低的miR-152表達抑制腫瘤細胞的凋亡，不利于治療。此觀點與既往的一些研究結果類似，如有研究發現miRNA-152可以抑制NSCLC的生長和侵襲能力，過低的miRNA-152表達增加了腫瘤細胞增殖[5]。

當然，miRNA在腫瘤的耐藥中要發揮作用，必然通過其靶基因，具體機制涉及：(1)miRNA可以調節一系列耐藥相關蛋白。如miR-298可以抑制MDR-1的表達，進而減少P-糖蛋白的表達，起到緩解乳腺癌細胞耐藥的作用。相反，miR-27a激活MDR-1，引起腫瘤細胞耐藥[12]；(2)miRNA可以影響藥物的靶點蛋白，從而引起耐藥性的改變。如在小細胞肺癌中，miR-126可以血管內皮生長因子為靶基因，減少其表達，后者為貝伐單抗的靶點，因此miR-126可以增加miRNA對貝伐單抗的敏感性[13]；(3)miRNA可以影響藥物的轉運。研究發現miR-206可以靶向抑制連接蛋白，后者發揮轉運藥物的功能，其功能受限后，會導致藥物不能向鄰近細胞轉運；(4)miRNA可以影響藥物引起的細胞死亡。如miR-21可以下調Bax的水平，從而抑制凋亡發生[9]。

雖然很多研究發現miR-152在腫瘤中存在低表達，且具有抑制腫瘤的功能[14-15]，但未見有研究報道miR-152與化學治療耐藥的關系。本研究中，使用miR-152 minic上調A549/DDP細胞的miR-152后，發現原本耐藥的細胞對DDP的敏感性提高了。同時發現miR-152 mimic降低耐藥細胞中Bcl-2和NF-κB的表達水平。因此，作者認為miR-152可能通過調節Bcl-2和NF-κB發揮藥物敏感性的調節作用。Bcl-2和NF-κB均為公認的抗凋亡基因。大量研究證實，肺癌、胃癌、卵巢癌，以及結腸癌等均存在Bcl-2和NF-κB過表達，二者的抗凋亡作用在腫瘤細胞的惡性增殖過程中扮演重要角色，與侵襲和轉移行為密切相關[16-17]。在耐藥性研究方面，Hall等[18]發現Bcl-2可以作為生殖系統腫瘤化學治療的靶點，較高的Bcl-2意味著較差的預后。Sun等[19]發現肺腺癌A549細胞中的NF-κB表達過高，抑制NF-κB的表達可以增加A549對化學治療藥物的敏感性。本研究中miR-152表達上調后，Bcl-2和NF-κB表達減少，抗凋亡減弱，這可以解釋為何原本耐藥的A549/DDP細胞對DDP的敏感性得到了提高。但Bcl-2和NF-κB是否是miR-152的直接靶基因，還是miR-152調節通路下游的某個環節，需要進一步的研究證實。

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Relation between microRNA-152 expression and cisplatin resistance in non-small cell lung cancer cells and its mechanism

GuoDi1,LiHongyun1△,YangHua2

(1.DepartmentofRespiration;2.DepartmentofGeneralSurgery,FifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China)

Objective To investigate the action mechanism of microRNA-152(miRNA-152) in the cisplatin(DDP) resistance process in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods The miRNA-152 level in NSCLC cell line A549 and its cisplatin-resistant cell line A549/DDP was detected by the real time quantitative PCR(qRT-PCR).miRNA-152 mimic was transfected for increasing the intracellular miRNA-152 level in A549/DDP.The MTT assay,inverted miroscope technique and flow cytometry were adopted to observe the effect of up-regulating miRNA-152 on cell proliferation inhibition and apoptosis,meanwhile,the level changes of intracellular Bcl-2 and NF-κB were also observed by adopting qRT-PCR and Western blot.Results The low expression of miRNA-152 and the high expression of Bcl-2 and NF-κB were found in A549/DDP cells.Up-regulation of miRNA-152 enhanced the inhibitory effect of DDP in A549/DDP cells.Furthermore,after up-regulating miRNA-152,the inhibiting rate and apoptosis rate of A549/DDP cells caused by DDP were significantly higher than those in the cells without up-regulating miRNA-152,the difference was statistically significant(P<0.05).In addition,miRNA-152 mimic transfection significantly decreased the expression of Bcl-2 and NF-κB in A549/DDP cells.Conclusion Low expression of miRNA-152 may induce the resistance of NSCLC to DDP,miRNA-152 could mediate the sensitivity of NSCLC cells to DDP via regulating Bcl-2 and NF-κB levels.

carcinoma,non-small-cell lung;microRNAs；Bcl-2；NF-κB;cisplatin;drug tolerance

郭迪(1980-)，主治醫師，碩士，主要從事呼吸內科研究。△

，E-mail:drliofres@163.com。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.001

R734.2

A

1671-8348(2016)10-1297-05

2015-11-08

2015-12-20)