電針復合七氟烷麻醉對斷尾大鼠急性應激反應調控的影響*

胡 越,劉 莉,熊威威,譚 毅,黃志華,李愛國,楊 華，蔣奕紅△

(1.桂林醫學院研究生院,廣西桂林 541001；2.湖北省武漢市第三醫院麻醉科 430000; 3.桂林醫學院附屬醫院麻醉科,廣西桂林 541001;4.桂林醫學院附屬醫院中醫科，廣西桂林 541001)

電針復合七氟烷麻醉對斷尾大鼠急性應激反應調控的影響*

胡 越1,劉 莉2,熊威威3,譚 毅3,黃志華3,李愛國3,楊 華4，蔣奕紅3△

(1.桂林醫學院研究生院,廣西桂林 541001；2.湖北省武漢市第三醫院麻醉科 430000; 3.桂林醫學院附屬醫院麻醉科,廣西桂林 541001;4.桂林醫學院附屬醫院中醫科，廣西桂林 541001)

目的 探討不同穴位電針刺激復合七氟烷麻醉對斷尾大鼠急性應激反應調控作用的影響。方法 健康成年雄性SD大鼠50只，體質量280～320 g，分為正常組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、七氟烷吸入組(Ⅲ組)、七氟烷吸入加體針組(Ⅳ組)和七氟烷吸入加耳針組(Ⅴ組)，每組10只。Ⅰ組不作處理置于氧流量30%的混合氣體玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅱ組斷尾后置于氧流量30%的混合氣體玻璃箱中(流量2 L/min)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組斷尾后置于含體積分數為2%的七氟烷麻醉箱中(流量2 L/min)，Ⅳ組持續刺激雙側“足三里”穴30 min (刺激參數3 V，3 Hz，2 ms)，共4次，每次間隔30 min，Ⅴ組刺激雙側“耳尖”穴，刺激參數及時間同Ⅳ組。各組治療方法結束后，處死各組大鼠，取斷頸血采用ELISA測促腎上腺皮質激素(ACTH)和外周血皮質酮(CORT)水平。采用Western blot法測定下丘腦組織c-fos蛋白的表達水平。結果 與Ⅰ組相比，Ⅱ組血清ACTH、CORT水平、下丘腦c-fos蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠外周血ACTH、CORT水平均有所下降,差異有統計學意義(P<0.05)；Ⅲ組與Ⅳ組的ACTH和CORT水平差異無統計學意義(P>0.05)；Ⅴ組的ACTH水平與Ⅲ組相比明顯下降(P<0.05)，Ⅴ組CORT水平與Ⅳ組相比明顯下降(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組c-fos表達與Ⅱ組相比均降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組3組組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論 七氟烷吸入復合電刺激“耳尖”穴治療時，對應激的作用優于單純的七氟烷治療和七氟烷復合電刺激“足三里”穴。電針復合吸入全身麻醉對應激的調控機制可能與下丘腦調節室旁核c-fos蛋白分泌并影響下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸有關。

應激；電針；原癌基因蛋白質c-fos；七氟烷；耳針

應激(stress) 是機體對各種刺激產生的一些非特異性反應。機體主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸分泌的應激激素來調節并完成對應激的適應。HPA多以外周血中促腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質酮(CORT)水平變化作為應激調控的外周指標[1]，以c-fos蛋白作為中樞調控應激的敏感因子[2]。研究表明，電針復合全身麻醉可降低肺切除患者圍術期的應激反應[3]，電針復合頸叢阻滯也能顯著降低甲狀腺患者圍術期的應激反應[4]。臨床應用多以體針復合麻醉，而實際操作中體針多受手術操作及體位的局限，而耳針不僅操作靈活且便于術中管理。但目前耳針復合麻醉對應激的調控作用不明。本研究通過對外周血清ACTH、CORT水平和下丘腦c-fos蛋白表達的變化，探討電針體穴和耳穴復合全身麻醉對斷尾大鼠應激反應的影響，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取50只成年雄性SD大鼠(桂林醫學院動物實驗中心提供)，體質量280～320 g,按照晝夜節律性飼養，即在12 h光照和12 h黑暗的條件下喂養,自由攝食和飲水。動物在實驗環境中適應1周后進行正式實驗。

1.2 試劑及儀器 大鼠ACTH、CORT ELISA試劑盒(華美Cusabio公司)，兔抗人多克隆c-fos抗體(1∶1 000，Santa Cruz公司)，山羊抗兔辣根標記二抗 (1∶5 000)、山羊抗小鼠辣根標記二抗(1∶5 000)、DAB(Sigma公司)，鼠抗β-actin(1∶1 000，中杉金橋公司)，SAB試劑盒(武漢博士德生物技術公司)。儀器：華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫療用品廠生產)，Bio-Rad蛋白電泳系統、Bio-Rad電轉膜儀、七氟烷揮發罐(Datex-Ohmeda公司)，ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾特生物科技有限公司)，麻醉氣體監護儀(Datex-Ohmeda)，IPP6.0凝膠成像系統。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 采用隨機數字表達法分為5組,分別為正常組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、七氟烷吸入組(Ⅲ組)、七氟烷吸入加體針組(Ⅳ組)和七氟烷吸入加耳針組(Ⅴ組)，每組10只。

1.3.2 急性應激模型制備 大鼠常規飼養，除Ⅰ組外各組大鼠采用低位尾干切斷(ICTR)的方法模擬急性應激，即用鼠籠固定大鼠后，在靠近尾端的尾干處(S3和S4脊髓神經之間)橫切。

1.3.3 處理方法和取材 參照Lee等[5]的方法，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠均通入體積分數2%的七氟烷氣體。將大鼠放入體積約為30 cm×20 cm×20 cm的玻璃麻醉箱中，箱底鋪滿石灰，用Ohmeda揮發罐給予七氟烷行麻醉誘導和維持，Datex麻醉氣體監護儀與氣管導管連接，用于監測呼氣末七氟烷水平，使箱內七氟烷的水平維持在2%，再將大鼠置入玻璃箱。對Ⅳ組和Ⅴ組進行電針刺激治療，在翻正反射消失后，將大鼠從七氟烷麻醉箱中迅速拿出，接上電針后立即放回麻醉箱中。按照《實驗針灸學》[6]進行取穴：Ⅳ組取“足三里”對應大鼠的后三里位于膝關節后外側腓骨小頭下約5 mm處脛腓骨間，直刺7 mm，給予“疏密波”，參數設置為3 V，3 Hz，2 ms[7]。取穴完成后，迅速放回體積分數維持在2%的七氟烷麻醉箱中，電針刺激30 min 1次，每2次間隔30 min，共4次電刺激治療。Ⅴ組在“耳尖”穴：位于耳尖后緣，針刺時沿耳廓橫刺2 mm，各項刺激參數、持續時間同Ⅳ組。處理結束時，各組大鼠斷頸取血5 mL，隨后取下丘腦組織置于液氮中，以備檢測以下指標。

1.3.4 血清ACTH、CORT水平的檢測 血樣加入不凝管中，在常溫下靜置2 h后，4 ℃，3 500 r/min，離心15 min，取上清液-20 ℃保存，采用ELISA試劑盒檢測ACTH和CORT水平，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3.5 下丘腦組織c-fos蛋白水平測定 待測時將組織從液氮中取出，用液氮研磨并裂解后，提取蛋白質,進行蛋白定量,用Western blot法檢測下丘腦組織c-fos蛋白的變化。按5 μg/mL的比例將組織裂解液加入到下丘腦組織內,勻漿后,12 000 r/min離心吸取上清液測定總蛋白含量(BCA蛋白測定法)。取40 μg蛋白質,加熱變性后,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,用電轉膜儀(Bio-Rad)將凝膠上的蛋白質轉印到聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含10%脫脂奶粉和0.1% Tween-20的Tris緩沖液 (TBST) 常溫封閉60 min,然后進行免疫雜交反應。首先加入1∶1 000的兔來源的c-fos抗體(Santa Cruz公司),4 ℃孵育過夜。用新鮮配制的TBST洗滌后,加入山羊抗兔抗體二抗,抗體滴度為1∶5 000,室溫孵育78 min。用TBST洗滌后,在暗室內加增強化學發光劑 (West Pico),壓X線片(柯達)。同一Western雜交膜顯示c-fos條帶后,用TBST洗滌PVDF膜30 min,然后用同樣的方法顯示β-actin條帶,以此作為加樣的內參照。X 線片上的條帶經凝膠成像系統讀其灰度值,并進行定量。以c-fos條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來糾正上樣量的偏差。用灰度比值的高低表示c-fos蛋白水平的多少。

2 結 果

2.1 各組外周血血清ACTH、CORT水平比較 與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組血清ACTH、CORT水平明顯升高(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組ACTH、CORT水平均有不同程度下降(P<0.05)。Ⅲ組與Ⅳ組的ACTH和CORT水平差異無統計學意義(P>0.05)；而Ⅴ組的ACTH水平與Ⅲ組相比明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅴ組的CORT水平與Ⅲ組相比差異無統計學意義(P>0.05)。Ⅳ組與Ⅴ組相比，兩組間ACTH水平差異無統計學意義(P>0.05)，但CORT水平Ⅴ組較Ⅵ組低 (P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清ACTH、CORT水平比較(±s，n=10)

a：P<0.01，與Ⅰ組比較;b:P<0.05，與Ⅱ組比較；c:P<0.05,與Ⅲ組比較；d:P<0.05,與Ⅳ組比較。

2.2 各組下丘腦組織c-fos蛋白表達情況 Ⅰ組c-fos表達很少，斷尾應激后，Ⅱ組c-fos表達明顯上調(P<0.01)，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組c-fos表達減少(P<0.01)；與Ⅲ組比較，Ⅳ、Ⅴ組的c-fos表達均下調(P<0.01)；Ⅳ、Ⅴ組間表達有差異，且Ⅴ組表達低于Ⅳ組(P<0.01)，見圖1、表2。

圖1 各組下丘腦c-fos蛋白Western印記X-線片顯影結果

組別nc?fos蛋白表達Ⅰ組100．16(0．15，0．18)Ⅱ組101．91(1．89，1．92)aⅢ組101．13(1．12，1．14)abⅣ組101．02(1．00，1．04)abcⅤ組100．66(0．60，0．73)bcd

a：P<0.01，與Ⅰ組比較；b：P<0.01，與Ⅱ組比較；c：P<0.01，與Ⅲ組比較；d：P<0.01，與Ⅳ組比較。

3 討 論

本研究參照Xu等[8]采取低位尾干切斷的方法制造急性創傷性應激的模型，操作簡便且模型效果顯著。有研究證實[9]，電針“足三里”可通過抑制下丘腦神經元進而調整HPA軸功能異常，以減輕急性創傷大鼠術后應激。同時，電針大鼠“耳尖”穴對慢性應激也有一定的調控作用[10]。固選取“足三里”和“耳尖”復合全身麻醉進行效果對比。

c-fos蛋白的表達被廣泛認為是神經元興奮的標志[11]。在非應激的基礎狀態,腦部c-fos表達水平很低；由張云東等[12]的研究結果可知，創傷后應激早期下丘腦c-fos快速表達，但促腎上腺素釋放激素(CRH)的表達遲于c-fos的表達過程,說明創傷應激反應中下丘腦早期表達的c-fos可能起激活CRH基因表達的作用。并有研究表明[13]，急性疼痛應激傳入后,激活下丘腦室旁核(PVN)c-fos mRNA轉錄，表達c-fos蛋白，并作為第3信使與CRH mRNA位點結合激活CRH mRNA轉錄，使下丘腦釋放CRH至垂體并入血，從而啟動HPA軸。本研究結果顯示，斷尾給予的急性刺激后，外周血中血清ACTH和CORT水平顯著升高，且下丘腦c-fos表達升高，即急性應激模型制備成功，隨后在給予電針加七氟烷吸入后，c-fos表達降低，可能的機制為電針復合七氟烷作用后大鼠下丘腦激活的c-fos神經元減少，則轉錄合成的CRH也隨之減少。因此，CRH激活HPA軸后釋放入血的ACTH水平也隨之降低，ACTH刺激腎上腺皮質釋放的CORT也同時減少。有實驗證實[14]，電針“百會”“神門”等穴可下調血清CORT和ACTH水平,作用機制可能與電針調節HPA軸的功能有關；臨床上將電針復合七氟烷麻醉用于神經外科手術中，也驗證了電針復合麻醉作用對術后早期鎮痛和恢復有良好的效果[15]。在本實驗中，電針復合七氟烷全身麻醉作用后，升高的外周血清ACTH和CORT水平均有不同程度的回落，即證實了電針聯合七氟烷吸入全身麻醉對應激的調控作用是有效的，而各治療組大鼠的下丘腦c-fos蛋白表達降低證實下丘腦調控HPA軸跟通過減少c-fos蛋白表達有關。

實驗中發現，Ⅳ與Ⅴ組作用效果比較時，Ⅴ組對應激下調的作用強于Ⅳ組，即電刺激“耳尖”穴復合七氟烷麻醉對斷尾應激的調控優于電刺激體穴“足三里”復合七氟烷全身麻醉。相比于體穴，耳部有豐富的迷走神經分布。應激傳入興奮交感神經啟動HPA軸，電針刺激耳穴時，一方面可以通過下丘腦系統調節交感神經和副交感神經的平衡，興奮迷走膽堿能神經纖維抑制交感腎上腺素能作用，調節激素水平變化[16]；另一方面能通過激活鎮痛機制，抑制痛覺信號傳遞，達到鎮痛作用從而降低疼痛誘發的應激反應[17]。多途徑多系統的參與可能是耳穴復合七氟烷全身麻醉作用優于體穴的原因。

總之，電針復合七氟烷麻醉法對急性應激的調控有明確效果，其機制與PVN分泌c-fos蛋白有關，耳針復合七氟烷比體針復合七氟烷的調控作用效果好。電針復合藥物麻醉應用于臨床時，不僅可以有效減輕圍麻醉期應激反應的作用，還對預防術后疼痛及術后惡心嘔吐等術后并發癥的發生有顯著作用[18]，值得臨床大力推廣。

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Effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on regulation of acute stress response in docked tails rats*

HuYue1，LiuLi2，XiongWeiwei3，TanYi3，HuangZhihua3，LiAiguo3，YangHua4,JiangYihong3△

(1.GraduateSchool，GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541001,China;2.DepartmentofAnesthesiology,ThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan,Hubei430000,China;3.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin，Guangxi541001,China;4DepartmentofTraditionalChineseMedicine，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin,Guangxi541001，China)

Objective To investigate the effect of electro-acupuncture combined with sevoflurane anesthesia on the regulation of acute stress response in docked tails rats．Methods Fifty male SD rats weighing 280-320 g were randomlsy divided into 5 groups(n=10 each)：normal group (group Ⅰ),model group (group Ⅱ),sevoflurane group (group Ⅲ),sevoflurane inhalation combined with body acupuncture group (group Ⅳ) and sevoflurane combined with auricular acupuncture group (group Ⅴ).The group Ⅰwas placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min) without treatment,the group Ⅱafter docking tail was placed in a glass box containing mixture gas with oxygenflow of 30% (flow 2 L/min),the group Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ were placed in the 2% sevoflurane anesthesia box (flow 2 L/min),the group Ⅳ was given continuous stimulation at Zusanli (stimulation parameters:3 V，3 Hz，2 ms) for 30 min per time,4 times at intervals of 30 min,the groupⅤ was given the stimulation at Erjian with the same stimulation parameters as the groupⅣ.Rats in each group were killed after treatment and the blood at broken neck was collected for measuring serum corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) levels by ELISA.The c-fos protein expression level in hypothalamic tissue was detected by Western blot.Results Compared with the group Ⅰ,serum ACTH,CORT levels,hypothalamic expression of c-fos protein in the group Ⅱwere significantly increased (P<0.01),compared with the group Ⅱ,the peripheral blood ACTH,CORT levels were decreased with statistical difference (P<0.05);the ACTH,CORT levels had no statistical difference between the group Ⅲ and Ⅳ(P>0.05);the ACTH level in the groupⅤ was significantly decreased compared with the groupⅢ(P<0.05) and the CORT level in the group Ⅴ was also decreased when compared with the group Ⅳ(P<0.05).The c-fos expression in the groupⅢ,Ⅳ and Ⅴwere decreased compared with the groupⅡ(P<0.05),there were significant difference among the group Ⅲ,ⅣandⅤ(P<0.05).Conclusion In the treatment of sevoflurane inhalation anesthesia combined with compound electrostimulation at Erjian,its effect on stress response is superior to simple sevoflurane treatment and sevoflurane combined with compound electrostimulation at Zusanli.The regulation mechanism of electro-acupuncture combined with inhalation general anesthesia on stress may be related with hypothalamus regulating paraventricular nucleus c-fos protein secretion and affecting the HPA axis.

stress;electroacupuncture;proto-oncogene proteins c-fos;sevoflurane;auricular acupuncture

2013年廣西中醫藥民族醫藥繼承創新工程(GZZC13-20)。

胡越(1989-)，在讀碩士，主要從事圍術期的應激調控及術后并發癥的防治研究。
△

，E-mail:jiangyihong@163.com。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.003

R245.97;R614

A

1671-8348(2016)10-1306-03

2015-11-18

2015-12-28)