神經元特異性烯醇化酶和U266細胞株對破骨樣細胞作用的研究*

袁忠濤，卿 晨，李曉進，張學美，史明霞，黃 穎，李惠民△

(1．昆明醫科大學第一附屬醫院血液科 650032；2.昆明醫科大學藥學院暨重點實驗室 650500； 3.昆明醫科大學第四附屬醫院血液科 650021)

神經元特異性烯醇化酶和U266細胞株對破骨樣細胞作用的研究*

袁忠濤1，卿 晨2，李曉進3，張學美1，史明霞1，黃 穎1，李惠民1△

(1．昆明醫科大學第一附屬醫院血液科 650032；2.昆明醫科大學藥學院暨重點實驗室 650500； 3.昆明醫科大學第四附屬醫院血液科 650021)

目的 探討神經元特異性烯醇化酶(NSE)和人多發性骨髓瘤細胞U266對人破骨樣細胞(OLC)功能的影響。方法 采用正常人外周血單個核細胞加用細胞核因子κB受體激治蛋白配體(RANKL)+巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的方法誘導培養OLC；實驗分3組，NSE組：將6孔培養板中培養14 d的OLC，分別加入100 ng/mL重組人NSE培養24、48、72 h；共培養組：將6孔Transwell小室下室中培養14 d的OLC，各上室分別加入1×105/孔U266細胞進行共培養24、48、72 h；對照組：單獨培養的OLC。通過實時熒光定量PCR比較 NSE和U266細胞株對OLC的RANKL、擴胃蛋白(OPG)、IL-6和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) mRNA轉錄水平的影響。結果 共培養組、NSE組和對照組RANKL、OPG、IL-6 mRNA在OLC均不表達；與對照組相比，共培養組、NSE組的TRAP mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)；TRAP mRNA表達水平的升高尤其以48 h和72 h明顯。結論 本試驗中OLC表達TRAP，NSE是促進骨髓瘤骨病中OLC分化和成熟的因素，提示NSE能增強OLC的活性。

磷酸丙酮酸水合酶；骨髓瘤骨病；破骨細胞；酸性磷酸酶

骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)是影響多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者生存質量和預后的主要因素[1]，MBD的發生、發展是多因素作用的結果，MM細胞活化破骨細胞(osteoclast,OC)，抑制成骨細胞(osteoblast,OB)活性，導致骨代謝失衡是其主要的病理生理機制，其中OC為主要的效應細胞[2]。細胞核因子κB(NF-κB)受體激活蛋白(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)/NF-κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor κB lisand，RANKL)/護骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)系統是耦聯OB和OC功能最重要的方式，RANKL為Ⅱ型跨膜蛋白,主要由OB和基質細胞產生，是介導OC分化和活化的關鍵因子[3]。RANKL在MM患者來源的漿細胞中高表達，而且有溶骨病變患者的表達水平明顯高于無溶骨病變者[4]。RANK屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，可表達于OC的前體細胞和成熟的OC表面。RANKL與RANK結合后促使OC前體細胞分化成OC而產生溶骨效應，同時RANKL通過NF-κB和Jun N-終端激酶(JNK)途徑，直接活化成熟的OC，促進骨的重吸收[5]。OPG是RANKL的可溶性誘導受體，可競爭性阻止RANK與RANKL結合，抑制OC的分化和活化。MM細胞除影響RANKL的表達外，還可抑制OB和基質細胞分泌OPG，從而減少骨髓微環境中的OPG。在MM患者中OPG產生明顯減少，RANKL/OPG比例失調，造成骨代謝失衡，促進溶骨病變的同時也促進瘤細胞本身的增殖，最終造成OC活化與骨髓瘤進展的惡性循環[6]。MM細胞本身不表達OPG，但可通過細胞間的相互作用直接抑制骨髓基質細胞表達OPG[7]。破骨樣細胞(osteoclast-like cell,OLC)功能與OC相似[8]，人外周血單個核細胞誘導培養的OLC為研究提供了細胞來源。OLC能分泌并表達特異性標志酶抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，TRAP能參與骨吸收的調節[8]。神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolas,NSE)在多種實體瘤和MM等血液腫瘤中均有表達[9-12]，且與溶骨性病變有關[13]，但NSE在MBD中如何起作用，對OC的影響如何尚不清楚。本研究旨在通過人外周血單個核細胞誘導培養OLC，并通過NSE和人多發性骨髓瘤細胞株U266對OLC的作用，觀察NSE對OLC功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 外周血來源于8名健康志愿者，其中男3名，女5名，平均年齡(25.1士2.4)歲，血常規正常；人多發性骨髓瘤細胞株U266由第二軍醫大學上海長征醫院侯健教授惠贈傳代培養。主要試劑：RANKL和人巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)購自英國PeproTech公司，TRAP染色試劑盒購自南京建成生物研究所，TRIzol試劑購自美國Roche公司，逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，RANKL、OPG、IL-6和TRAP基因擴增相關引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細胞誘導培養OLC

1.2.1.1 分離人外周血單個核細胞 抽取外周血20 mL，置于含1 mL無菌肝素鈉生理鹽水(1 000 U/mL)的50 mL離心管中，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，充分混勻，并分為兩等份(各20 mL)；另取兩支50 mL離心管，分別加入20 mL淋巴細胞分離液(Ficoll)，將裝有Ficoll液的離心管傾斜45°，用尖頭吸管將等體積的稀釋標本沿管壁(距離液面1 cm處)緩慢加入離心管，使其輕鋪在Ficoll液上，2 000 r/min離心25 min，小心吸取單個核細胞層置于新的離心管；加入5倍體積PBS重復洗滌細胞2次(1 500 r/min離心10 min)，獲得單個核細胞；加入含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培養液，將細胞吹打均勻。取部分細胞懸液，加入適量NH4Cl裂解液裂解殘存的紅細胞，2 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10% FBS的α-MEM培養液重懸細胞，吸取10 μL置于血細胞計數板上，計算細胞濃度。

1.2.1.2 細胞的純化 將上述單個核細胞的密度重調，以1.5×106/mL種植于25 cm2培養瓶，每瓶加入含10% FBS和100 IU/mL青、鏈霉素的α-MEM培養液5 mL，置于在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內孵育。24 h后輕輕倒去瓶中的上清液，用不含FBS的α-MEM培養基反復沖洗，去除未貼壁細胞。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)液，常溫消化1～3 min后置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓，立即加入含10%FBS的α-MEM培養液終止胰蛋白酶的作用。用彎頭吸管輕輕吹打細胞，待細胞脫離瓶壁，吸取細胞懸液，將細胞懸液1 000 r/min離心10 min，棄上清液。

1.2.1.3 OCL的誘導培養 將上述分離的人外周血單個核細胞以1.5×106/mL種植于培養瓶，進行細胞純化；將純化的細胞以5×105/孔的密度接種于96孔培養板(預先將牙質片層鋪入培養板中)及1×106/mL的密度接種于6孔和24孔培養板，加入含重組人RANKL 100 ng/mL、M-CSF 50 ng/mL 和10% FBS的α-MEM培養液在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內誘導培養。

1.2.1.4 細胞形態學觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態變化和分化。

1.2.1.5 OCL的鑒定 TRAP染色：取培養14 d左右的細胞爬片，經洗滌、固定和清洗；按照TRAP染液說明書具體步驟進行染色，并用蘇木素復染，清洗后自然風干；水性封片劑封片后光鏡觀察TRAP陽性細胞，照相。骨吸收陷窩觀察：取出96孔培養板誘導培養28 d OLC作用的牙質片層，經清洗、固定、風干及乙醇梯度脫水等處理，掃描電鏡觀察OLC對牙質片層的骨質破壞情況。

1.2.2 實驗分組 NSE組：將6孔培養板中培養14 d的OLC，分別加入100 ng/mL重組人NSE培養24、48、72 h；共培養組：將6孔Transwell小室下室中培養14 d的OLC，各上室分別加入1×105/孔U266細胞進行共培養24、48、72 h；對照組：單獨培養的OLC。每孔設3個平行復孔。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測OLC的RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA轉錄水平的表達情況 按預設時間點收集NSE組、共培養組和對照組樣本,采用Trizol試劑盒，嚴格按照試劑操作說明提取單個核細胞的總RNA,紫外分光光度儀測定RNA 含量及純度，反轉錄合成cDNA，以GAPDH作為內參照對cDNA產物行PCR擴增，各目的基因擴增引物見表1。擴增過程為95 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 15 s變性，59 ℃ 20 s退火，68 ℃ 50 s延伸，40個循環結束反應。實時熒光定量PCR檢測目的基因表達：反應結束后，以GAPDH為內參照，實時熒光定量PCR檢測RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表達，由 ABI7300隨機軟件分析擴增曲線和產物熔解曲線，按照相對定量公式 2-△△Ct計算目的基因參照管家基因的相對含量，每一標本設置3個平行管，以3個平行管所得到Ct值的均值計算，比較各組RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表達情況。

表1 擴增引物序列

2 結 果

2.1 細胞形態學觀察結果 倒置顯微鏡下觀察誘導培養6～7 d,有個別單個核細胞體積增大，出現融合現象,形態多為圓形或橢圓形，14 d左右可觀察到圓形、橢圓形、長條形、漏斗形或不規則形的多核巨細胞，見圖1。

2.2 TRAP染色結果 誘導培養14 d，取出細胞爬片進行TRAP染色，可觀察到圓形、橢圓形、長條形、漏斗形或不規則形的細胞，體積較大，細胞質豐富,細胞質內可見酒紅色顆粒沉積，部分細胞質中可見大小不等空泡,核數個，呈淡黃色，細胞核清晰，大小不一,聚積在細胞中央或排列在細胞周邊。蘇木素復染后細胞核染呈藍色，細胞質仍為酒紅色，見圖2。

2.3 牙質片層掃描電鏡結果 誘導培養OLC 28 d，骨片表面可見形態不規則的吸收陷窩，常規培養組(未進行誘導培養)對照組骨片表面未見骨吸收陷窩，見圖3。

A：3 d；B：7 d；C：12 d；D：14 d。

圖1 人外周血單個核細胞經RANKL+M-CSF誘導下不同時間段的細胞形態(×200)

A：TRAP染色(×200);B：TRAP染色(×400);C：TRAP染色+蘇木素復染(×200);D：TRAP染色+蘇木素復染(×400)。

圖2 誘導培養14 d TRAP染色的細胞形態

A：對照組(SEM×1 000);B：誘導培養組(SEM×1 000)。

圖3 骨吸收陷窩掃描電鏡觀察

a:P<0.01,與對照組比較；b:P<0.01,與24 h比較。

圖4 3組不同時間TRAP mRNA表達水平的變化趨勢圖

2.4 各組OLC時RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA表達情況 共培養組、NSE組及對照組RANKL、OPG、IL-6 mRNA均不表達；共培養組、NSE組與對照組相比，TRAP mRNA轉錄水平的表達呈升高趨勢，差異有統計學意義(P<0.01)。共培養組、NSE組48 h和72 h TRAP mRNA的表達水平高于24 h，差異有統計學意義(P<0.01)，兩組48 h和72 h TRAP mRNA的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；對照組24、48、72 h TRAP mRNA的表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖4。

3 討 論

正常情況下，骨形成和骨吸收處于動態平衡狀態，這是骨重塑過程。OC和OB是這一過程中的主要細胞，協調成骨與破骨的動態平衡，從而維持骨的相對穩定[14]。OC是體內生理狀態下惟一有骨吸收功能的細胞，在生理性骨重建和病理性骨吸收中起重要作用[15]。OC在受到MM細胞或骨髓微環境中其他細胞的刺激下，可致細胞數量增多，功能活躍，出現溶骨增強[16]。

OC是高度分化的終末細胞，體外分離的細胞只能存活7～14 d，且獲得的細胞數量有限。經誘導培養的OLC在功能上與OC相似，相對容易獲得、純度較高。本試驗參照文獻方法[17-19]，采用正常人外周血單個核細胞加用RANKL+M-CSF的方法誘導培養OLC，為MBD的體外研究提供可靠的細胞來源。

OC從發育、成熟、活化再到發揮骨吸收功能經歷一個復雜、多級的調節過程，而OC的分化和成熟是調控整個骨吸收過程的重要靶點，RANK/RANKL/OPG系統在介導OC分化和成熟方面起到關鍵的作用。RANKL與OC和破骨前體細胞膜表面表達的RANK結合，能促進OC的分化、成熟，增強其活性，抑制凋亡[20]。本研究中OLC不表達RANKL，與文獻報道一致[21]。成熟的OC和OLC分泌并高表達TRAP，且具有噬骨功能[8]。本試驗中OLC表達TRAP，并能在牙質片層片上形成骨吸收陷窩，也驗證了本研究誘導培養的細胞為OLC；而且試驗結果顯示共培養組和NSE組TRAP的表達上調，提示在體外MM細胞和NSE能增強OLC的活性。

烯醇化酶是參與糖酵解途徑中2-磷酸甘油酸轉化成磷酸烯醇式丙酮酸的限速酶，它由α、β、γ亞基以二聚體形式組成免疫性質不同的αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5種同工酶；其中γγ、αγ主要存在于神經元和神經內分泌細胞中，稱為NSE[22]。另有實驗證實正常的T和B淋巴細胞在特定發展階段也表達NSE[23]，這說明NSE不是神經內分泌細胞所特有的。Li等[24]研究發現在體外NSE能促進人視網膜母細胞瘤細胞的增殖，并認為NSE是一種神經細胞生存和營養因子。MM細胞株U266表達NSE，MM患者血清中也發現NSE水平明顯升高，且與臨床分期、骨損害程度及治療效果存在相關性。應用NSE處理OLC，TRAP mRNA轉錄水平的表達上調，提示NSE促進OLC的分化和增殖；NSE具有U266細胞對OLC的類似作用；推測NSE可能通過細胞代謝或作為營養因子起作用，但是否有其他某種方式的參與尚不清楚，目前國內外亦無這方面研究的報道，值得進一步探討。

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Study on effect of NSE and U266 cell line on osteoclast-like cells*

YuanZhongtao1,QingChen2,LiXiaojin3,ZhangXuemei1,ShiMingxia1,HuangYing1,LiHuimin1△

(1.DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China; 2.CollegeofPharmacy,KeyLaboratory,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China; 3.DepartmentofHematology,FourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China)

Objective To explore the functions of neuron-specific enolase(NSE) and human multiple myeloma U266 cells on osteoclast-like cells(OLC) function.Methods Normal human peripheral blood mononuclear cells were induced and cultured by adding RANKL and M-CSF to get OLC;the experiment was divided into 3 groups,the NSE group:OLC were cultured in the 6-well culture plate for 14 d and added with 100 ng/mL recombinant human NSE to culture for 24,48,72 h;the co-culture group:OLC were cultured in the lower well of 6-well Transwell chamber for 14 d,then added with 1×105/well U266 cells in each upper well and conducted the co-culture for 24,48,72 h;the control group:OLC were cultured alone.The influences of NSE and U266 cell line on RANKL,OPG,IL-6 and TRAP mRNA transcriptional level of OLS were compared by using real-time fluorescent quantitative PCR.Results RANKL,OPG,IL-6 mRNA had no expression on OLC in the co-culture group,NSE group and control group;compared with control group，the TRAP mRNA expression level in the co-culture group and the NSE group was increased,the difference was statistically significant(P<0.01);the increase of TRAP mRNA expression level was obvious especially at 48,72 h.Conclusion OLC expressing TRAP and NSE may be one of the factors for promoting OLC differentiation and maturation in myeloma bone disease,prompting that NSE could increase the OLC viability.

phosphopyruvate hydratase;myeloma bone disease;osteoclast;acid phosphatase

云南省應用基礎研究面上項目(2007C0037R)。

袁忠濤(1974-)，主治醫師，碩士，主要從事血液腫瘤研究。
△

，E-mail:lihuimin@medmail.com.cn。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.004

R783.5

A

1671-8348(2016)10-1309-04

2015-12-15

2016-01-22)