奇魅植物酵素對小鼠酒精性肝損傷保護作用的研究

秦 松，王 君，高志鵬，柳長柏，鄒黎黎△

(1.三峽大學醫學院腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002； 2.湖北省宜昌市第一人民醫院細胞治療研究所 443000)

奇魅植物酵素對小鼠酒精性肝損傷保護作用的研究

秦 松1，王 君2，高志鵬1，柳長柏1，鄒黎黎1△

(1.三峽大學醫學院腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002； 2.湖北省宜昌市第一人民醫院細胞治療研究所 443000)

目的 探討奇魅植物酵素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用。方法 用連續灌服酒精的方法建立小鼠酒精性肝損傷模型，將60只雄性昆明小鼠分為5組：空白對照組，模型組，低劑量組、中劑量組、高劑量組(模型組基礎上分別加5、25、50 mL/kg 奇魅植物酵素)。連續灌胃9周后，測定各組小鼠血清中天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性。測定各組小鼠肝組織中丙二醛(MDA)、三酰甘油(TG)、還原性谷胱甘肽(GSH)、乙醇脫氫酶(ADH)及乙醛脫氫酶(ALDH)的活性，以及肝指數的變化及肝組織病理學觀察。結果 成功建立小鼠酒精性肝損傷模型；與模型組比較，各劑量組的奇魅植物酵素均可有效地降低血清中AST、ALT及肝組織中TG水平，提高ADH、ALDH、GSH水平。此外，病理學觀察結果與酶學變化相一致。結論 奇魅植物酵素對小鼠酒精性肝損傷有一定的保護作用。

奇魅植物酵素；肝疾病，酒精性；保護作用

酒精性肝損傷是指長期大量飲酒或含有酒精的飲料造成的肝臟疾患，20世紀90年代以前酒精性肝病(alcoholic liver disease)是發達國家常見的肝臟疾病，經常飲酒可導致脂肪肝，可加快脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的進程[1-5]。2004年全球3.8%的人類死于飲酒，酒精會導致多器官損傷，其中以肝臟損傷尤為顯著，其發病機制復雜，較為公認的是氧化應激可能是酒精性肝損傷的驅動力[6-9]。臨床上采用傳統抗氧化劑維生素A和維生素E治療酒精性肝損傷，但療效不佳。因此酒精性肝損傷的防治已成為醫學上的一個重要研究課題。

奇魅植物酵素是將數十種藥食同源的中草藥，經混合菌種發酵研制而成。本實驗以湖北富程祥云生物科技有限公司提供的奇魅植物酵素為研究對象，旨在探討其對小鼠酒精性肝損傷的保護作用，為進一步研究和開發植物酵素的藥用價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SPF級昆明小鼠60只，雄性，由三峽大學實驗動物中心提供[湖北省實驗動物質量合格證：SCXK(鄂)2011-0061]；奇魅植物酵素由湖北富程祥云生物科技有限公司提供，樣品受理編號：三峽大學第SDHZ2013071號。丙二醛(MDA)、三酰甘油(TG)、還原性谷胱甘肽(GSH)試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)標準品及組織測定試劑盒購自南京建成生物工程公司。乙醇及其他主要試劑均為國產分析純，由三峽大學醫學院腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室提供。

1.2 儀器與設備 MIKRO 120高速離心機(德國Zentrifogen公司)；DL-600S型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設備有限公司)；組織切片機 HM 340E(德國Microm公司)；CS-Ⅵ型攤片烤片機(孝感市宏業醫用儀器有限公司)；包埋機 EG1150H,多功能顯微鏡NPS60(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立及分組 參考馬曉茜[10]的模型建立方式，將小鼠分為5組，即低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組和空白對照組，每組12只。根據生產廠家提供人群推薦日攝入量，奇魅植物酵素分別擴大1、5、10倍(即5、25、50 mL/kg)作為實驗的低、中、高劑量組。將小鼠禁食12 h后，奇魅植物酵素劑量組分別灌胃1、5、10倍的植物酵素(5、25、50 mL/kg奇魅植物酵素)，模型組和空白對照組分別灌胃等量的蒸餾水。30 min后，奇魅植物酵素各劑量組和模型組灌胃42%的酒精，空白對照組灌胃等量的蒸餾水，連續灌胃60 d。實驗期間每2天稱1次體質量，根據體質量變化調整灌胃劑量。

1.3.2 樣品處理 實驗結束后將小鼠禁食12 h，眼球取血，離心后取血清，待測其生化指標天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性。將小鼠頸椎脫臼處死后，取出小鼠肝臟：(1)肝臟稱質量計算臟體系數；(2)取小塊肝組織勻漿，進行MDA、TG、GSH、ADH及ALDH水平測定；(3)取部分肝組織進行病理組織學檢查，取出動物肝臟觀察形態學變化,立即用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，6 μm切片，普通蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察，以肝細胞變性及壞死作為觀察指標。

2 結 果

2.1 模型構建情況 與空白對照組比較、模型組血清AST、ALT,肝組織MDA、TG、GSH、ADH，ALDH等指標差異有統計學意義，說明酒精性肝損傷小鼠模型構建成功，見表1～2。

2.2 各組小鼠血清AST、ALT的活性及肝指數變化 中劑量組和高劑量組的AST、ALT的活性明顯低與模型組(P<0.01)。各劑量組肝指數低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 奇魅植物酵素對各組小鼠血清AST、ALT的活性及肝指數的影響(±s,n=12)

a:P<0.05，b：P<0.01，與模型組比較。

2.3 各組小鼠肝組織ADH、ALDH的活性及TG、GSH、MDA水平變化 各劑量組肝組織的ADH、ALDH活性及GSH水平明顯高于模型組(P<0.05)。TG、MDA水平低于模型組(P<0.05)，見表2。

2.4 各組小鼠肝組織病理切片觀察 HE染色結果表明模型組正常小葉結構消失，肝索排列紊亂，細胞間無明顯分界，局部呈碎屑狀壞死，匯管區炎癥細胞浸潤明顯。低劑量組、中劑量組和高劑量組肝細胞損傷明顯輕于模型組，中劑量組、高劑量組尤為明顯，見圖1。

表2 奇魅植物酵素對各組小鼠ADH、ALDH活性及TG、GSH、MDA水平的影響(±s,n=12)

a:P<0.05，b:P<0.01,與模型組比較。

A:空白對照組;B:模型組;C：低劑量組;D：中劑量組;E：高劑量組。

圖1 肝臟HE染色(×200)

3 討 論

肝臟是酒精代謝的主要場所，長期大量飲酒會引起酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾病。而奇魅植物酵素包含消化酶如糖化酶、脂肪酶等酶類成分，富含益生菌，且低能量、無脂肪。更值得一提的是，與化學藥品、中藥制劑等解酒藥相比，奇魅植物酵素是通過代謝酶解酒，不會給肝腎造成代謝負擔及任何不良反應。已有研究表明植物酵素具有良好的潤腸通便[8]、解酒醒酒[9]的作用。本文旨在探討植物酵素對酒精性肝損壞的保護作用。

ALT 和AST 是存在于肝細胞質和線粒體中的轉氨酶，當肝細胞嚴重病變、壞死時，ALT 和AST就會滲漏入血，所以血清ALT 和AST活性升高為肝細胞損傷的特異性指標，而肝臟病理學檢查則被認為是判斷肝臟損傷的金標準[10]。本實驗采取連續灌胃的方法建立慢性酒精性肝損傷模型[11]，發現模型組小鼠血清ALT 和AST活性水平明顯升高，肝臟出現明顯的脂肪和炎癥性病理學改變，證實小鼠酒精性肝臟損傷模型建立成功。研究發現與模型組相比，中劑量和高劑量組的ALT、AST的活性和MDA的水平顯著降低，GSH的水平顯著升高。這與夏偉等[12]發現樺木酸可以改善酒精對小鼠的機體損傷，降低ALD大鼠血清中AST、ALT的活性水平，上調肝組織總蛋白的水平及提高肝組織中GSH，降低MDA的水平的指標有相同的效用。而MDA是機體進行脂質過氧化作用的終產物，MDA的水平反應組織過氧化的程度[13]，由此說明植物酵素可能是通過抗氧化作用來保護肝臟的。

飲酒后，約90%在肝內代謝，進入體內的酒精大部分通過ADH代謝轉化為乙醛，乙醛再經ALDH的作用，代謝為無毒的乙酸。然而，乙醛代謝為乙酸的速度較慢，易導致乙醛在體內蓄積[14]。乙醛可與肝細胞中的蛋白質、DNA發生螯合，形成乙醛加合物，如MDA-乙醛加合物等。諸多乙醛加合物可導致受其影響的蛋白發生變構，失去應有的功能，從而引起肝細胞功能受損[15-17]。另外酒精性肝損傷可出現輕度的黃疸和肝臟腫大，肝質量常達正常肝臟的2～3倍。本研究發現各劑量組肝組織中的ADH、ALDH的水平均顯著降低，同時肝指數也顯著降低。說明奇魅植物酵素可能是通過促進酒精在肝組織中的代謝來保護肝臟的。

綜上所述，高劑量的奇魅植物酵素可以有效地改善酒精性肝損傷，其作用機制可能與抗氧化作用和促進酒精代謝有關，其藥用價值有待進一步開發。

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Protection of Qimei Fermented Beverage against alcohol-induced liver injury in mice

QinSong1,WangJun2,GaoZhipeng1,LiuChangebai1,ZouLili1△

(1.HubeiProvincialKeyLaboratoryofTumorMicroenvironmentandImmunotherapy,MedicalCollege,ThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China;2.InstituteforCellTherapy,YichangMunicipalFirstPeople′sHospital,Yichang,Hubei443000,China)

Objective To explore the protective effect of Qimei Fermented Beverage against alcohol-induced liver injury in mice.Methods Alcohol-induced liver injury mouse model was established by continuously intragastric administration.Totally 60 male mice were randomly divided into five groups,blank control group,model group,low,middle and high doses groups(adding 5,25,50 mL/kg Qimei Fermented Beverage).After continuous intragastric administration for 9 weeks,the levels of serum aspartate transaminases(AST) and alanine transaminases(ALT) were detected in each group,moreover the levels of malondialdehyde(MDA),triglyceride(TG),glutathione(GSH) and alcohol dehydrogenase(ADH),aldehyde dehydrogenase (ALDH) of liver homogenate,and liver index change were measured.Liver histopathological changes were observed.Results The alcohol-induced liver injury model in mice was successfully established.Compared wit model group,different doses groups of Qimei Fermented Beverage could effectively reduce the levels of serum AST,ALT and liver tissue TG,increased the levels of ADH,ALDH,GSH.In addition,the pathological examination results of liver were consistent with those in enzymology.Conclusion Qimei Fermented Beverage has certain protective effect against alcohol-induced liver injury and can obviously improve the alcohol-induced liver injury.

Qimei fermented beverage;liver disease,alcoholic;protective effect

秦松(1988-)，在讀碩士，主要從事生物化學與分子生物學研究。△

，E-mail:zoulili@ctgu.edu.cn。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.008

R285

A

1671-8348(2016)10-1323-03

2015-11-08

2015-12-20)