家族性偏癱性偏頭痛CACNA1A基因新突變的研究*

劉祥琴，馬勛泰，杜 瓊，晏 寧

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610071;2.西南醫科大學附屬醫院神經內科,四川瀘州 646000;3.重慶醫科大學附屬大學城醫院神經內科 401331)

家族性偏癱性偏頭痛CACNA1A基因新突變的研究*

劉祥琴1，馬勛泰2，杜 瓊1，晏 寧3△

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610071;2.西南醫科大學附屬醫院神經內科,四川瀘州 646000;3.重慶醫科大學附屬大學城醫院神經內科 401331)

目的 探索家族性偏癱性偏頭痛(FHM)與CACNA1A基因突變的關系。方法 通過提取一家系患者和健康人及1 000例健康對照組DNA進行CACNA1A基因測序研究，并進行生物信息學分析。結果 位于CACNA1A基因的8號外顯子的新突變位點(c.1168A>G)導致天門冬酰胺替換為天冬氨酸(N390D)。結論 CACNA1A基因突變N390D是新發現的引起FHM的致病突變因素。

先兆偏頭痛；基因,CACNA1A;點突變

偏頭痛是一種復雜的慢性血管紊亂性疾病，以發作性搏動性頭疼為特征，表現為一側或雙側頭部跳痛，伴有惡心、嘔吐等植物神經癥狀，是與心理、社會因素相關的常見心身疾病。家族性偏癱性偏頭痛(familial hemiplegic migraine,FHM)是一種比較少見的帶有先兆性的較嚴重疾病，它常呈單基因常染色體顯性遺傳。目前，已報道有CACNA1A、ATP1A2、SCN1A 3種基因突變與該病有關。CACNA1A 基因，定位于19p13,編碼P/Q 型鈣離子通道的1A亞單位,全世界范圍內找到了18 個不同的錯義突變,其中T666M 與R1347Q 突變是最常見的兩種突變[1-4]，由于CACNA1A基因是目前公認的與FHM尤其是與伴小腦功能紊亂癥狀相關的致病基因[1,5-7]，本研究就在一家系樣本中針對該基因進行研究，對CACNA1A基因進行測序，發現的新突變位點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究家系來源于重慶醫科大學附屬大學城醫院神經內科收集的一個FHM家系，該家系有3代4人患病，目前有3例患者存活，家系圖見圖1，所有病患表現有偶發的偏癱性偏頭痛發作，腦脊液淋巴細胞增多，除了先證者女兒(Ⅲ∶1)外，均有眼球震顫等小腦功能紊亂的表現。所有患者腦電圖未見有明顯異常，先證者的(Ⅱ∶1)還有共濟失調的表現，MRI檢查提示有小腦萎縮，其余患者未見小腦影像學改變。診斷符合2004年國際頭痛協會頭痛分類委員會制訂的《偏頭痛診斷標準》，并排除其他類型頭痛、脊髓小腦型共濟失調、癲癇等其他神經系統疾病[8]。健康對照組樣本采集于2015年1月至2015年6月，在四川省人民醫院健康體檢中心隨機選擇健康體檢者1 000例，年齡10～85歲，平均(46.5±12.1)歲，排除偏頭痛、偏癱及脊髓小腦型共濟失調、癲癇等其他神經系統疾病及這些神經系統家族史。采集標本前實驗參與者均簽署了知情同意書，本研究通過四川省人民醫院醫學倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取家系中偏頭痛患者和健康對照組靜脈血5 mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，采用酚氯仿抽提乙醇沉淀法提取基因組DNA。

1.2.2 CACNA1A基因測序 CACNA1A基因包含47個外顯子，其cDNA包含2 506個氨基酸，參考Ophoff RA的文獻結合引物設計軟件Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，作者設計了43對引物[1]，采用Sanger測序法進行雙向測序，測序試劑為BigDye Terminator Cycle 測序試劑盒(Applied Biosystems)，按照試劑說明書操作，使用測序儀為ABI 3130xl，序列分析軟件采用Chromas1.62，測序結果通過DNAman 8.0軟件進行比對。

1.3 生物信息學分析 通過SIFT HOME(http://sift.jcvi.org/)和NCBI的HomoloGene進行突變的初步生物信息學分析，序列的比對應用DNAman 8.0軟件。

2 結 果

2.1 測序結果 在3位偏頭痛患者CACNA1A基因測序結果中均發現一新突變，該基因8號外顯子第1 168核苷酸A突變為G雜合雙峰(c.1168A>G)，在1 000例健康對照組人群及家系中健康成員則未發現此突變，見圖2。

圖1 FHM家系圖

第8號外顯子第1 168位核苷酸顯示患者A/G雜合雙峰(箭頭所指)，表示在該位點A突變為G。

圖2 CACNA1A基因突變位點DNA序列圖

2.2 生物信息學分析結果 該CACNA1A基因新突變導致第390位氨基酸密碼子由AAT替換為GAT，編碼氨基酸由天冬酰胺突變為天冬氨酸N390D。該突變位置氨基酸在各物種中相當保守，通過9個物種比對未見該位點有變化。該突變經SIFT軟件分析預測為“DAMAGE”突變(SIFT Score=0.02分)，見圖3。

結果顯示該段蛋白及突變點(紅色框內)氨基酸序列非常保守，突變可能導致疾病的發生。

圖3 9個物種氨基酸序列比對

3 討 論

本研究在一個偏頭痛家系中發現由CACNA1A基因一個錯義突變(c.1168A>G，N390D)引起的一系列偏癱性偏頭痛臨床表現，包括偶發的偏癱性偏頭痛發作，遲發性的小腦功能紊亂，輕度的腦脊液細胞增多。值得注意的是，雖然患者發生的偏癱次數不多，但這也符合《偏頭痛診斷標準ICHD-Ⅱ》對偏癱性偏頭痛的診斷[8]。

在此家系中，本研究認為CACNA1A基因氨基酸的390位天門冬酰胺錯義突變為天門冬氨酸,導致偏癱性偏頭痛，主要有以下證據：(1)CACNA1A基因編碼形成一個由4個同源亞基組成的跨膜域這是已知功能的重要通道的電壓傳感器[6]，CACNA1A基因是目前公認報道的與FHM尤其是伴小腦功能紊亂癥狀的致病基因[1,5-7]。(2)第390位天門冬酰胺、天門冬氨酸突變在本研究家系中表現出明顯的遺傳共分離現象；(3)該突變的區域位于CACNA1A基因的相當穩定的區域，從NCBI Gene Bank中查詢比對的9種由高級到低級的物種該區域的氨基酸都是一樣的，說明該段序列在進化上是相當保守穩定的，該突變勢必會導致疾病的發生[1]， 在本突變附近的第388、389位已有錯義突變導致共濟失調的文獻報道[9-10]。(4)該突變區域位于同源結構域Ⅰ和Ⅱ之間，負責與β亞基結合。(5)在1 000個健康人未發現有CACNA1A基因的此種氨基酸突變，故認為此種突變有可能導致FHM的發生。

電壓依賴的鈣通道調節鈣離子進入興奮的細胞,參與激素或神經遞質釋放、肌肉收縮和基因表達等各種鈣依賴過程。鈣通道復合體由α1、β、α2、δ,γ亞基組成，其中起主要作用的是α1亞基，其余亞基主要起調節作用。各種不同類型的鈣通道主要是α1亞基不同(包括α1A、α1B、α1C、α1D、α1E和α1S)，CACNA1A基因編碼電壓門控鈣離子通道上的孔道形成蛋白α1A亞基。CACNA1A表達在與偏頭痛相關的大腦皮質、三叉神經節及腦干神經核等神經組織。這個基因的突變與FHM和共濟失調有關。神經遞質的釋放、神經元的興奮都由位于神經元、突觸前膜及樹突通道鈣離子通過電壓門控鈣離子通道進入突觸后膜而調節。

在本研究中，該突變區域位于同源結構域Ⅰ和Ⅱ之間，該區域負責與β亞基結合，推測該突變可能會導致α1A亞基與β亞基結合的調節異常，而引起CACNA1A蛋白這一P/Q型離子流的密度和門控特性的改變，致使鈣通道的功能改變，從而導致神經元的過度興奮及持續去極化，繼發皮層擴布性抑制(cortical spreading depression，CSD)的闊值降低，引發偏頭痛[11-12]。該家系病患發生的遲發性進展性的小腦綜合征也是偏癱性偏頭痛的臨床表現之一，據報道約有40%～50%的CACNA1A突變患者有小腦綜合征表現[7]。

綜上所述，本研究在一個偏頭痛家系中發現CACNA1A基因一個新的錯義突變(N390D)，該突變可導致FHM，可能還與小腦綜合征的發生有關。該研究的發現不僅擴大了偏頭痛致病基因突變譜，而且更加肯定了CACNA1A基因突變會導致FHM、小腦功能紊亂，共濟失調等神經系統疾病的發生。但該突變導致該疾病的發生機制還有待通過轉基因動物的構建進行下一步的研究。

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Study on novel mutation of CACNA1A gene in familial hemiplegic migraine*

LiuXiangqin1,MaXuntai2,DuQiong1,YanNing3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610071,China;2.DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofNeurology,UniversityTownHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

Objective To investigate the relationship between familial hemiplegic migraine (FHM) with the mutation of CACNA1A gene.Methods Total genomic DNA of a family affected members and 1 000 normal controls was extracted for conducting the CACNA1A gene sequencing research and the bioinformatics analysis.Results The novel mutation site c.1168A>G of exon located in CACNA1A gene led to Asn to be replaced with Asp (N390D).Conclusion The mutation(N390D) of CACNA1A gene is a newly found novel pathogenic mutation lead to familial hemiplegic migraine.

migraine with aura; genes,CACNA1A; point mutation

重慶市自然科學基金項目(cstc2012jjA10093)；四川省人民醫院青年基金項目[省醫行(2014)94號]。

劉祥琴(1978-)，主管技師，碩士，主要從事分子遺傳學研究。△

，E-mail:852188765@qq.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.016

R277.7

A

1671-8348(2016)10-1348-02

2015-12-08

2016-01-26)