乳品中熱帶假絲酵母菌的雙抗夾心ELISA快速檢測(cè)方法

常 江,劉 熙,柳增善,任洪林,盧士英,胡 盼,李巖松,蓋冬雪,金 雯,張 嵩,孟憲梅

(1.人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062;2.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130507; 3.廣澤乳業(yè)有限公司,吉林長(zhǎng)春 130102)

乳品中熱帶假絲酵母菌的雙抗夾心ELISA快速檢測(cè)方法

常 江1,2,劉 熙3,柳增善1,*,任洪林1,盧士英1,胡 盼1,李巖松1,蓋冬雪1,金 雯1,張 嵩1,孟憲梅2,*

(1.人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062;2.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130507; 3.廣澤乳業(yè)有限公司,吉林長(zhǎng)春 130102)

本研究用于乳品中熱帶假絲酵母菌的快速檢測(cè)。采用熱帶假絲酵母菌超聲破碎后的上清蛋白作為免疫原分別免疫新西蘭大耳白兔和Hartley豚鼠,獲得熱帶假絲酵母菌的多克隆抗體。以兔抗體作為捕獲抗體,豚鼠抗體作為檢測(cè)抗體,通過(guò)矩陣法及正交分析建立乳品中熱帶假絲酵母菌快速、特異的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。該方法檢出限為98 ng/mL,板內(nèi)變異系數(shù)小于2%,板間變異系數(shù)小于6%,特異性及重復(fù)性良好。實(shí)際樣品檢測(cè)中,通過(guò)對(duì)乳制品進(jìn)行濾膜集菌并選擇性增菌培養(yǎng),超聲后提取的蛋白上清應(yīng)用本研究建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法,100 CFU/mL熱帶假絲酵母菌可在22 h內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)。

乳品,熱帶假絲酵母菌,雙抗夾心ELISA,快速檢測(cè),選擇性增菌,濾膜集菌

熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)是一種腐物寄生的真菌微生物,廣泛存在于乳制品、水果、蔬菜中,并可存在于人體皮膚、陰道等部位。該菌大小約為3～6 μm,對(duì)環(huán)境條件的抗性較強(qiáng),對(duì)熱的抵抗力不強(qiáng),有假菌絲和厚壁孢子,是常見(jiàn)的條件致病菌[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),由熱帶假絲酵母菌引起的奶牛乳房炎病例不斷增多[2]。該種乳房炎在臨床診斷中多不易查明,因而用藥缺乏針對(duì)性。臨床上對(duì)奶牛乳房炎的治療多使用抗生素,但長(zhǎng)期使用抗生素對(duì)真菌性乳房炎治療無(wú)效并可導(dǎo)致病情惡化,[3]使奶牛產(chǎn)奶量急劇下降,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。常規(guī)的培養(yǎng)檢測(cè)方法主要有國(guó)標(biāo)法和熒光定量方法。國(guó)標(biāo)法對(duì)酵母菌的檢測(cè)需要5～7 d,耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣;熒光定量方法雖耗時(shí)短,但成本較高,操作環(huán)境要求嚴(yán)格[5]。本研究建立乳品中熱帶假絲酵母菌的雙抗夾心ELISA檢驗(yàn)方法,能夠快速、準(zhǔn)確、特異地檢驗(yàn)出熱帶假絲酵母菌含量,對(duì)真菌性乳房炎的發(fā)生和治療具有重要意義。

表1 因素水平設(shè)計(jì)

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新西蘭大耳白兔、Hartley豚鼠 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(吉)2012-0002;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、卡那霉素、氨芐青霉素、Tween-20 Sigma公司;山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記 博士德公司;山羊抗豚鼠IgG/l辣根酶標(biāo)記 博奧森公司;A型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒 Galaxy公司;TMB顯色液、PDA培養(yǎng)基 本實(shí)驗(yàn)室制備;不同廠家生產(chǎn)或不同種類(lèi)乳制品及酸乳制品 購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市零售超市;熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)、馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichi kudrivzevii)、阪崎桿菌(Bntorobater sakazakii)、中間葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis) 吉林大學(xué)人獸共患病研究所細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室保藏。

AKTA 100蛋白純化儀 美國(guó)GE公司;Epoch酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司;DHP120恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;AIRTECH生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;微孔板振蕩器 德國(guó)IKA公司;Allegra X-22R離心機(jī) 德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo生物有限公司;超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫原的制備 復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室保藏的熱帶假絲酵母菌株,接種于PDA培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩24 h,8000 r/min離心10 min收集菌體。潔凈的PBS洗滌三次后重懸菌沉淀,超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌懸液,參數(shù)設(shè)置為:總時(shí)間50 min,作用4 s,間歇2 s,功率70%。超聲后8000 r/min離心取上清可溶性蛋白[5],Bradford法[6]檢測(cè)蛋白濃度。

1.2.2 兔多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定 雌性新西蘭大耳白兔(2.37 kg)1只,耳緣靜脈采血后收集陰性血清備用。首次免疫原量為1 mg,皮下多點(diǎn)注射,之后每?jī)芍茏芳用庖咭淮巍Ｃ看蚊庖吆?周測(cè)定效價(jià),至第五次免疫1周后心臟采血。效價(jià)測(cè)定使用間接ELISA方法,包被10 μg/mL抗原,對(duì)檢測(cè)血清和陰性血清分別倍比稀釋,結(jié)果以檢測(cè)血清OD值/陰性血清OD值(P/N)≥2.1為指標(biāo)判定兔多克隆抗體的效價(jià)[7]。

1.2.3 豚鼠多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定 SPF級(jí)Hartley豚鼠(約750 g)2只,免疫原量為500 μg,免疫程序與效價(jià)測(cè)定同1.2.2。

1.2.4 抗體的純化與辣根酶(HRP)的標(biāo)記 用HiTrap Protein G HP親和層析柱純化抗血清[8]。純化后的抗體加入透析袋,經(jīng)PBS(pH=7.2)透析48 h,每6 h換液一次[9]。透析完成后,放入PEG-2000濃縮體積至2 mL。純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證純化效果,并用Bradford法[6]檢測(cè)抗體濃度。采用A型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒制備酶標(biāo)抗體,紫外分光光度計(jì)測(cè)量A403 nm/A280 nm,計(jì)算HRP標(biāo)記率(LR)[10]。

1.2.5 雙抗夾心ELISA方法的初步建立 純化的兔抗體用碳酸鹽緩沖液1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀釋后包被于酶標(biāo)板,每孔100 μL,37 ℃溫浴2 h后,0.1% PBST洗滌3遍,每遍1 min。加入封閉液,每孔200 μL,37 ℃溫浴1 h,洗板3遍。加入抗原10 μg/mL,每孔100 μL,37 ℃溫浴1 h,洗板3遍。豚鼠HRP標(biāo)記抗體用PBS分別1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700稀釋,每孔100 μL,37 ℃溫浴1 h,洗板4遍后TMB顯色液,終止反應(yīng)后測(cè)量450 nm處的OD值。

1.2.6 雙抗夾心ELISA方法的條件優(yōu)化 利用L8(25)和L18(35)正交表對(duì)包被時(shí)間、封閉液選擇、抗原稀釋液選擇、檢測(cè)抗體稀釋液選擇進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)SPSS分析選擇ELISA反應(yīng)的最適條件,正交實(shí)驗(yàn)[12]設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.7 雙抗夾心ELISA方法檢出限的確定 將熱帶假絲酵母菌菌體蛋白從300 μg/mL倍比稀釋至36.62 ng/mL,根據(jù)1.2.6優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件,以抗原濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),P/N為縱坐標(biāo),選擇P/N≥2.1的點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13],確定本方法的檢出限。

1.2.8 雙抗夾心ELISA方法的特異性檢測(cè) 無(wú)菌條件下將熱帶假絲酵母菌、馬克斯克魯維酵母菌、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌、阪崎桿菌、中間葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌接種于PDA培養(yǎng)基中,在28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,按照1.2.1方法得到破碎后的全蛋白稀釋至2 μg/mL,以上述各菌菌體蛋白作抗原,檢測(cè)雙抗夾心ELISA方法的特異性[14]。

1.2.9 雙抗夾心ELISA方法的重復(fù)性檢測(cè) 分別檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)的板內(nèi)重復(fù)性和板外重復(fù)性[15],板內(nèi)重復(fù)5次,板間重復(fù)4次。板內(nèi)重復(fù)性:同一塊酶標(biāo)板隨機(jī)抽取5條酶標(biāo)反應(yīng)條,每條隨機(jī)選取4個(gè)酶標(biāo)反應(yīng)孔,用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)不同濃度的菌體蛋白,讀值后計(jì)算同一濃度下各孔間的變異系數(shù)。板間重復(fù)性:隨機(jī)抽取4個(gè)酶標(biāo)反應(yīng)板,每板選擇3個(gè)酶標(biāo)反應(yīng)孔,計(jì)算同一抗原濃度下各板間的變異系數(shù)。

1.2.10 熱帶假絲酵母菌的選擇性增菌培養(yǎng) 在PDA培養(yǎng)基中分別加入0.1%的卡納青霉素和0.1%的氨芐青霉素,分別接種100 CFU/mL熱帶假絲酵母菌、100 CFU/mL熱帶假絲酵母菌和100 CFU/mL大腸桿菌混合菌、100 CFU/mL熱帶假絲酵母菌和100 CFU/mL中間葡萄球菌混合菌,培養(yǎng)溫度為28 ℃,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為220 r/min[16]。繪制時(shí)間與菌液OD600值之間的生長(zhǎng)曲線圖,檢測(cè)選擇性增菌培養(yǎng)對(duì)細(xì)菌的抑菌效果。重復(fù)5次,計(jì)算經(jīng)選擇性增菌培養(yǎng)后,不同時(shí)間點(diǎn)菌液OD600之間的變異系數(shù),檢驗(yàn)熱帶假絲酵母菌在選擇性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)重復(fù)性。

1.2.11 乳品樣品的檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)樣品選取10種市售牛奶及酸乳制品,用建立的方法檢測(cè)其中熱帶假絲酵母菌含量。對(duì)乳品滅菌后進(jìn)行加標(biāo)回添實(shí)驗(yàn),分別接種30、100 CFU/mL熱帶假絲酵母菌于1 mL滅菌乳品樣品中,用0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液稀釋至10 mL。取直徑1.2 cm、口徑2 μm無(wú)菌濾膜[16]放入滅菌后的可換式集菌培養(yǎng)濾器中,將樣品稀釋液通過(guò)集菌培養(yǎng)濾器,濾凈后用10 mL 0.9%的無(wú)菌氯化鈉注射液沖洗一遍。無(wú)菌操作下取出濾膜,加入含有5 mL選擇性PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)[17]。增菌培養(yǎng)22 h后吸出菌懸液4 mL并離心收集菌體,用無(wú)菌PBS沖洗2遍后重懸至2 mL,超聲破碎菌體,操作同1.2.1。以30 CFU/mL和100 CFU/mL的接菌量在乳品中接菌,用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測(cè),28 ℃下以220 r/min振蕩培養(yǎng),檢測(cè)菌體蛋白可檢測(cè)出的準(zhǔn)確陽(yáng)性值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析,用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形處理。正交分析采用SPSS軟件,模擬正交分析表,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素主效應(yīng)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗血清效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA測(cè)定兔4免后抗血清效價(jià),結(jié)果如圖1,以該兔免疫前血清為陰性對(duì)照,此時(shí)效價(jià)約為64000。

圖1 兔抗血清效價(jià)曲線Fig.1 Titer cure of rabbit antisera

2.2 豚鼠抗血清效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA測(cè)定2只豚鼠4免后抗血清效價(jià),結(jié)果如圖2,以豚鼠免疫前血清為陰性對(duì)照,此時(shí)2只豚鼠效價(jià)均約為51200。

圖2 豚鼠抗血清效價(jià)曲線Fig.2 Titer cure of guinea pig antisera

2.3 抗體的純化與辣根酶(HRP)標(biāo)記

HiTrap Protein G HP親和層析柱分別純化兔抗體和豚鼠抗體,SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)兩種抗體的純化效果,結(jié)果如圖3。經(jīng)A型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒標(biāo)記后,檢測(cè)標(biāo)記率為0.724,可以正常使用[10]。

圖3 抗體純化結(jié)果Fig.3 Results of antibody purification注:M:Marker;1:兔多抗;2:豚鼠多抗。

2.4 最佳抗體對(duì)稀釋倍數(shù)的確定

通過(guò)棋盤(pán)法確定兩種抗體的最佳稀釋倍數(shù),由表2可見(jiàn),兔多抗稀釋200倍作為捕獲抗體,酶標(biāo)豚鼠多抗稀釋400倍作為檢測(cè)抗體時(shí)P/N值最大,選擇兔抗體200倍稀釋、豚鼠抗體400倍稀釋作為抗體對(duì)的最佳稀釋倍數(shù)。

表2 棋盤(pán)法對(duì)最佳抗體對(duì)稀釋倍數(shù)的細(xì)致摸索

2.5 雙抗夾心ELSIA方法的條件優(yōu)化

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件,每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)。表3優(yōu)化了兔抗體包被條件、封閉條件、抗原結(jié)合條件、豚鼠抗體檢測(cè)條件,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)結(jié)果可以說(shuō)明,封閉條件、豚鼠抗體稀釋液對(duì)P/N的影響顯著,其余因素影響不顯著,結(jié)合減少反應(yīng)時(shí)間的原則,選擇A1B1C1D2處理為最優(yōu)條件,即最佳反應(yīng)條件為:37 ℃包被1 h,NH4Cl封閉1 h,PBS稀釋抗原結(jié)合1 h,1%脫脂奶粉稀釋檢測(cè)抗體反應(yīng)1 h。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.6 雙抗夾心ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限的確定

對(duì)抗原標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,利用2.5得到的最優(yōu)反應(yīng)條件測(cè)定本ELISA方法的檢出限,以抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以測(cè)定孔OD值-陰性孔OD值為縱坐標(biāo),建立如圖4所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)P/N≥2.1的陽(yáng)性值判定標(biāo)準(zhǔn),本方法的檢出限為98 ng/mL。

2.7 雙抗夾心ELISA的特異性檢測(cè)

采用熱帶假絲酵母菌與其他菌株菌體蛋白作抗原,抗原濃度均調(diào)至2 μg/mL,以不同菌株為橫坐標(biāo),不同菌株菌體蛋白OD值與陰性孔OD值的比值(P/N)為縱坐標(biāo),檢驗(yàn)本研究雙抗夾心ELISA方法的特異性,結(jié)果如圖5,說(shuō)明該方法特異性?xún)?yōu)良。

2.8 雙抗夾心ELISA的重復(fù)性檢測(cè)

根據(jù)建立的方法對(duì)熱帶假絲酵母菌菌體蛋白做板內(nèi)和板間重復(fù)性檢測(cè),以變異系數(shù)為衡量指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表5、表6。根據(jù)結(jié)果可知,板內(nèi)變異系數(shù)小于2%,板間變異系數(shù)小于6%,所建ELISA方法重復(fù)性良好。

表5 板內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)

表6 板間重復(fù)性檢測(cè)

表7 選擇性增菌的重復(fù)性驗(yàn)證

2.9 選擇性培養(yǎng)基的抑菌檢測(cè)

繪制分別接種在選擇性PDA培養(yǎng)基上的100 CFU熱帶假絲酵母菌、100 CFU熱帶假絲酵母菌和100 CFU大腸桿菌混合菌、100 CFU熱帶假絲酵母菌和100 CFU沙門(mén)氏菌混合菌的菌液OD600值與時(shí)間之間的生長(zhǎng)曲線圖,結(jié)果如圖6。三種接種方法的生長(zhǎng)曲線相同,說(shuō)明選擇性培養(yǎng)基可有效抑制細(xì)菌,而不對(duì)熱帶假絲酵母菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

圖6 選擇性培養(yǎng)基抑菌檢測(cè)Fig.6 Detection of antibacterial in selective medium

2.10 選擇性增菌的重復(fù)性檢驗(yàn)

根據(jù)確定的增菌條件檢驗(yàn)選擇性增菌的重復(fù)性,以變異系數(shù)為指標(biāo),結(jié)果如表7,變異系數(shù)均小于10%,說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.11 提取熱帶假絲酵母菌全蛋白的方法分析

用熱法、堿熱法、超聲破碎法分別對(duì)熱帶假絲酵母菌的全蛋白進(jìn)行提取,采用間接ELISA方法檢驗(yàn)結(jié)合效果后,選擇超聲破碎法提取全蛋白。固定超聲破碎條件如1.2.11,以菌體蛋白濃度為橫坐標(biāo),以菌液OD600值為縱坐標(biāo),結(jié)果如圖7,說(shuō)明過(guò)低的增菌量可能導(dǎo)致處理中酵母菌體的損失,選用菌液OD600值大于0.1的菌液濃度用于本ELISA的檢測(cè)。

圖7 蛋白濃度與菌液OD600相關(guān)性曲線Fig.7 Protein concentration-bacteria OD600 correlation curve

2.12 乳品樣品中的檢測(cè)

10種乳制品經(jīng)前處理,28 ℃下以220 r/min振蕩培養(yǎng)22 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。以30 CFU/mL和100 CFU/mL的接菌量在乳品中接菌,28 ℃下以220 r/min振蕩培養(yǎng)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明,30 CFU/mL接菌量培養(yǎng)24 h后,提取蛋白可檢測(cè)出準(zhǔn)確陽(yáng)性值;100 CFU/mL接菌量培養(yǎng)22 h后,提取蛋白可檢測(cè)出準(zhǔn)確陽(yáng)性值,見(jiàn)表8。

表8 乳品樣品加標(biāo)回收檢驗(yàn)結(jié)果

注:“+”和“-”分別表示陽(yáng)性和陰性。

3 結(jié)論

酶標(biāo)板對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng),對(duì)大顆粒性抗原如酵母菌的吸附能力很差。因此,本研究采用濾膜集菌并通過(guò)具有選擇性的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行前增菌,對(duì)增菌后菌懸液超聲破碎,建立熱帶假絲酵母菌上清蛋白的雙抗夾心ELISA快速檢測(cè)方法。本研究獲得了熱帶假絲酵母菌上清蛋白的兔、豚鼠多克隆抗體,效價(jià)分別為1∶64000和1∶51200。建立的雙抗夾心ELISA方法經(jīng)優(yōu)化后,最佳反應(yīng)條件為:37 ℃包被1 h,NH4Cl封閉1 h,PBS稀釋抗原結(jié)合1 h,1%脫脂奶粉稀釋檢測(cè)抗體反應(yīng)1 h。所建立的雙抗夾心ELISA方法重復(fù)性好、特異性高,檢測(cè)限為98 ng/mL。經(jīng)過(guò)前處理并以所建雙抗夾心ELISA方法檢測(cè),100 CFU/mL接菌量在22 h后,經(jīng)超聲破碎并離心可檢測(cè)出準(zhǔn)確陽(yáng)性值。

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A double-antibody sandwich ELISA for detection ofCandidatropicalisin dairy product

CHANG Jiang1,2,LIU Xi3,LIU Zeng-shan1,*,REN Hong-lin1,LU Shi-ying1,HU Pan1,LI Yan-song1,GAI Dong-xue1,JIN Wen1,ZHANG Song1,MENG Xian-mei2,*

(1.Key Laboratory of Zoonosis,Ministry of Education,Institute of Zoonosis,Jilin University,Changchun 130062,China; 2.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province, Jilin Business and Technology College,Changchun 130507,China; 3.Ground Dairy Industry Co.,Ltd.,Changchun 130102,China)

This study focused on developing an rapid detection ofCandidatropicalisin dairy products. The soluble protein was expressed byCandidatropicalisas immunogen to obtain the polyclonal antibodies(PAbs)of rabbit and guinea pigs respectively. A sandwich ELISA detection method based on PAb pair targetingCandidatropicaliswas then established,in which rabbit PAb was capture antibody and guinea pig PAb was detection antibody. There was no cross reaction with miscellaneous bacteria or microzymes and the detection limits forCandidatropicaliswas 98 ng/mL,the intro-batch variation was less than 2%,and the inter-batch variation was less than 6%. During the actual sample tests,theCandidatropicalisin dairy were enriched by filter and selective cultural method,followed by the sandwich ELISA detection. The results showed that 100 CFU/mLCandidatropicaliscould be detected accurately in 22 h. The test results of this improved method were validated by national standard method.

dairy;Candidatropicalis;double-antibody sandwich ELISA;rapid detection;selective enrichment;collecting bacteria using millipore filter

2016-06-13

常江(1992-),男,在讀碩士研究生,研究方向:獸醫(yī)公共衛(wèi)生,E-mail:245661900@qq.com。

*通訊作者:柳增善(1959-),男,博士,教授,研究方向:獸醫(yī)公共衛(wèi)生,E-mail:zsliu1959@sohu.com。 孟憲梅(1964-),女,博士,教授,研究方向:食品安全,E-mail:mengxm222@sina.com。

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140204065NY);吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全應(yīng)用研究項(xiàng)目(2011-Y36);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201205054);糧油食品深加工省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2016003)。

TS252.7

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000