乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測進(jìn)展

賈靜

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州362000）

?綜述及其他?

乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測進(jìn)展

賈靜

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州362000）

本文通過文獻(xiàn)回顧的方式對關(guān)于乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測的方法及其進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。免疫組化的方法因其特異性高而成為目前乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測中的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其靈敏度稍低，而且由于各檢測單位缺乏統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)的檢測流程，故其臨床的應(yīng)用受到一定的限制。今后若能在大樣本量、隨機(jī)前瞻性研究的支持下，統(tǒng)一目前乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測中的分歧，必將對乳腺癌的診療起到極大的促進(jìn)作用。

乳腺癌；播散腫瘤細(xì)胞；檢測

1 乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞檢測的意義

乳腺癌是目前多見的女性惡性腫瘤之一。雖然其治療方法有了很大進(jìn)步，但總體生存率并沒有明顯改善，有研究發(fā)現(xiàn)，有50%非進(jìn)展期乳腺癌以及30%淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者在手術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，顯然，目前的乳腺癌TNM分期并不能準(zhǔn)確預(yù)測患者對治療的反應(yīng)以及預(yù)后等情況。目前，針對乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞的檢測是乳腺癌診療中的熱點(diǎn)問題，Braun等[1]對4703例可手術(shù)的乳腺癌患者進(jìn)行了5年的隨訪，結(jié)果證實(shí)，檢出播散腫瘤細(xì)胞是預(yù)測疾病早期復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立指標(biāo)。

2 可用于檢測的標(biāo)本

目前針對乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞的檢測主要是根據(jù)待檢組織和乳腺癌細(xì)胞的組織來源不同來進(jìn)行鑒別。對于乳腺癌患者而言，一旦在以下組織中檢測出上皮來源的細(xì)胞，即被認(rèn)為是乳腺癌細(xì)胞播散所致。

2．1 淋巴結(jié)

腋窩淋巴結(jié)以及內(nèi)乳淋巴結(jié)一直都是判斷乳腺癌預(yù)后好壞的重要因素。淋巴結(jié)連續(xù)切片被認(rèn)為是檢測乳腺癌有無局部侵犯的金標(biāo)準(zhǔn)。

2．2 外周血

2．3 骨 髓

乳腺癌主要通過淋巴系統(tǒng)和血循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行播散，而骨骼是乳腺癌經(jīng)血液播散后的常見定植器官。骨髓中檢出播散腫瘤細(xì)胞和乳腺癌患者的TNM分期以及疾病的復(fù)發(fā)、疾病相關(guān)死亡率之間都存在一定的相關(guān)性。

3 待檢標(biāo)本的富集技術(shù)

相比于待檢標(biāo)本中的正常細(xì)胞，播散腫瘤細(xì)胞所占的比例很小，因此，有必要對待檢標(biāo)本進(jìn)行富集、純化，以提高檢出率。目前常用的富集技術(shù)主要包括：

3．1 離心法

即利用離心機(jī)分離待檢標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞，常用的方法包括Ficoll法以及OncoQuick法等。

3．2 免疫磁化富集技術(shù)

使用連有微小磁珠的特殊抗體篩選目的細(xì)胞。經(jīng)磁化富集之后的標(biāo)本可進(jìn)一步利用免疫學(xué)技術(shù)或分子生物學(xué)技術(shù)檢測其中的播散腫瘤細(xì)胞。

④廊道。廊道的震損檢查信息包括裂縫、剝落、排水孔、滲水、滲流量等。其中，裂縫信息包括裂縫的位置、長度、深度以及寬度等，剝落信息包括剝落位置和程度，排水孔信息包括位置和現(xiàn)象，滲水信息包括位置和程度等。

4 檢測乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞的方法及其原理

4．1 細(xì)胞學(xué)水平

針對細(xì)胞水平的研究可以粗略的分為2大類：利用單克隆抗體＋形態(tài)學(xué)檢查和僅僅利用單克隆抗體檢測播散腫瘤細(xì)胞的方法。

4．1．1 基本原理 基于乳腺癌是來源于上皮組織的惡性腫瘤，而發(fā)源自內(nèi)胚層的造血組織在正常情況下是不能檢出上皮細(xì)胞，故一旦檢出，則認(rèn)為所檢出的上皮細(xì)胞就是源自惡性組織播散。

4．1．2 檢測方法 （1）免疫組織化學(xué)技術(shù)／免疫細(xì)胞技術(shù)（IHC/ICC）：其原理主要是應(yīng)用單克隆抗體與相應(yīng)特異性的腫瘤標(biāo)志物結(jié)合，在組織細(xì)胞原位對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位和定量的測量，該方法將免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性結(jié)合起來，在細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、

多肽、酶、癌基因和抑癌基因的產(chǎn)物、激素以及受體等。免疫組織化學(xué)技術(shù)可以同時(shí)集合免疫反應(yīng)的高度敏感性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的高度特異性，一方面提高檢測的敏感度，同時(shí)，免疫組化技術(shù)還可以對分離出來的異常細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察，進(jìn)一步確定此類細(xì)胞是否真的來源于惡性組織，從而在一定程度上降低了假陽性的發(fā)生率。免疫組化技術(shù)是目前檢測播散腫瘤細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測的敏感度可以達(dá)到1個(gè)上皮細(xì)胞/105-6個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞。

（2）流氏細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry）：利用單克隆抗體分離目的細(xì)胞，檢測速率較快，檢出率可疑達(dá)到1個(gè)陽性細(xì)胞/107血細(xì)胞。由于僅能檢測待檢標(biāo)本中的細(xì)胞表面的特定表達(dá)產(chǎn)物，而不能對被檢出細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察，因此存在一定的假陽性。

4．2 基因水平

4．2．1 基本原理 腫瘤細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（DNA）及其表達(dá)（mRNA）是不同于正常細(xì)胞的，轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞仍然表達(dá)具有起源組織特征的特異性標(biāo)記。我們可以應(yīng)用特殊的引物片斷擴(kuò)增出待檢標(biāo)本中的上皮細(xì)胞源性mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得相應(yīng)的上皮細(xì)胞源性cDNA，通過PCR的擴(kuò)增而增加待檢標(biāo)本中上皮細(xì)胞源性cDNA的含量，從而在理論上可以提高異常細(xì)胞檢出的敏感性。

4．2．2 具體方法 （1）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）：RT-PCR技術(shù)通過監(jiān)測上皮特異性mRNA或腫瘤特異性mRNA來發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者骨髓、外周血或淋巴結(jié)中的播散腫瘤細(xì)胞。

（2）巢式（nested）PCR：先用一隊(duì)外引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對內(nèi)引物擴(kuò)增第一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。

（3）實(shí)時(shí)RT-PCR（real-time RT-PCR）：可以在PCR處于對數(shù)增長階段時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)，而不需要經(jīng)過固定的傳代次數(shù)再進(jìn)行計(jì)數(shù)，而且不需要在PCR反應(yīng)結(jié)束后再進(jìn)行產(chǎn)物處理，從而避免了PCR反應(yīng)產(chǎn)物可能造成的污染。

5 主要的檢測標(biāo)記物

5．1 細(xì)胞角蛋白（CK）

細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞特有的中間細(xì)絲蛋白，細(xì)胞角蛋白家族至少包含20余種成員，每一種蛋白都由一種特異的基因所編碼。CK-19主要分布于單層上皮細(xì)胞，如腸上皮、乳腺、胰管、子宮內(nèi)膜等，當(dāng)這些組織癌變后角蛋白的組成不變，但含量增加，從而被認(rèn)為是檢測上皮細(xì)胞來源的癌細(xì)胞的普遍標(biāo)志物。

5．2 Mammaglobin

絕大多數(shù)的研究均證實(shí)，Mammaglobin僅表達(dá)于乳腺癌患者的外周血中，而不表達(dá)于正常人和乳腺良性疾病患者中；L.Mercatali等[2]應(yīng)用巢式RTPCR的方法檢測乳腺癌患者以及正常志愿者外周血中Mammaglobin mRNA的表達(dá)，結(jié)果7%的乳腺癌患者外周血中可以檢出Mammaglobin mRNA表達(dá)，而正常志愿者全部未能檢出，從而提示Mammaglobin作為檢測乳腺癌播散腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一，具有極高的特異性。

5．3 Maspin

Maspin屬于serpin蛋白酶家族，Maspin蛋白的表達(dá)可能與正常乳腺組織的癌變以及進(jìn)展有關(guān)。I Bie`che等[3]利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測Mapsin在乳腺癌組織中的表達(dá)，并討論其與乳腺癌患者病理學(xué)特征以及預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Maspin的表達(dá)與患者ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

5．4 乳腺上皮粘蛋白（small beast epithelial mucin，SBEM）

乳腺上皮粘蛋白的表達(dá)具有高度的特異性，僅在乳腺和唾液腺中表達(dá)。楊華偉等[4]利用巢式PCR技術(shù)檢測67例乳腺癌、16例乳腺良性腫瘤以及20例健康志愿者外周靜脈血中SBEM mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果67例乳腺癌患者外周血的表達(dá)率為50.7%（34/67），而良性腫瘤以及健康志愿者表達(dá)均為陰性，提示SBEM mNRA可作為檢測乳腺癌血行微小轉(zhuǎn)移的檢測指標(biāo)。SBEM mRNA的陽性表達(dá)率與臨床分期、淋巴結(jié)受累情況明顯相關(guān)，而與腫瘤的大小、激素受體情況等無關(guān)。

［1］ Braun S,Vogl FD,Naume B,et al:Apooled analysis ofbone marrow micrometastasis in breast cancer.N Engl J Med 353:793-802, 2005.

［2］ L.Mercatali,V.Valenti,D.Calistri,et al.RT-PCR determination of maspin and mammaglobin B in peripheral blood of healthy donors and breast cancer patients.Annals ofOncology17:424–428,2006

［3］ I Bie`che,I Girault,J-C Sabourin,S Tozlu,K Driouch,MVidaud and R Lidereau.Prognostic value of maspin mRNA expression in ERa-positive postmenopausal breast carcinomas.British Journal of Cancer(2003)88,863–870.

［4］ YangHW,CaoJ,YangNW,et al.Expression ofsmall breast epithelial mucin mRNA in peripheral blood of breast cancer patients and its clinical significance.Ai Zheng,2005,24(7):842-845.