心臟干細胞修復梗死心肌作用機制的研究進展

王艷　綜述　石蓓,2　審校

(1.遵義醫學院研究生院，貴州 遵義563003; 2.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義563003)

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心臟干細胞修復梗死心肌作用機制的研究進展

王艷1綜述石蓓1,2審校

(1.遵義醫學院研究生院，貴州 遵義563003; 2.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義563003)

【摘要】心臟干細胞被發現于哺乳動物心臟組織中已有十余年，在此期間的眾多研究均證實了心臟干細胞可再生修復梗死心肌，改善心臟功能。研究者們認為心臟干細胞發揮修復梗死心肌的作用機制可能與其固有特性相關，包括直接分化為功能心肌細胞，通過旁分泌各種細胞因子改善心肌梗死區域微環境，促進血管新生。現對心臟干細胞作用機制的研究現狀及所面臨的問題進行綜述，以期為轉化醫學發展與心臟疾病的防治開拓新的方向與策略。

【關鍵詞】心臟干細胞；外泌體；心肌梗死；再生治療

1前言

既往認為哺乳動物的心臟為終末分化器官，在衰老或受損后不再具備自我更新能力，但最近一些研究顯示，心臟具有不同程度的再生能力并能形成新的心肌細胞[1]。2003年 Beltrami等[2]就發現在成年哺乳動物心臟中含有少量具有再生功能的固有心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)，這些CSCs不光維持著心肌細胞衰老與新生的平衡，也負責心臟內其他類型細胞的新老交替，可能在心肌梗死后的心肌再生和心肌損傷的修復中發揮重要作用。后續研究進一步證實了CSCs為未分化細胞，主要存在于心房、心耳等部位，并具有較強的增殖分化能力，部分表達Nkx2.5、GATA4等早期轉錄因子，不僅可定向分化為心肌譜系細胞，如心肌細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞等，并具有組織特異性與低免疫原性等特點。其致瘤、致畸、致心律失常率較其他干細胞類型低，在移植治療心血管疾病中相對安全[3-4]。

2CSCs的來源和分類

目前在部分嚙齒類動物以及人的心臟組織中均發現CSCs的存在。但對于CSCs來源問題一直以來都備受爭議，一項異基因心臟移植的研究發現，部分CSCs表現骨髓系表型，這提示心臟外源性原始細胞可在某種內外源性刺激下，歸巢至心臟從而形成CSCs，而后分化為心肌譜系細胞[5]；此外Barile等[6]使用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉染至小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cell，BMSC)，隨后將其移植到野生型小鼠體內，心肌梗死后分離培養野生型小鼠CSCs，發現均表達EGFP，進一步驗證了CSCs骨髓來源的推測。然而大部分研究者更傾向于認為CSCs形成于胚胎期，出生后仍存在于心臟的干細胞龕中，并有研究證實可從大鼠和小鼠心臟組織中分離培養出CSCs[7-8]，隨后一項以小鼠為研究對象的實驗也證實了CSCs起源于胚胎期，并在小鼠成熟后仍持續存在[9]。

目前對于CSCs的鑒定尚無統一的標準，根據其表面標志物及生物學特征大致分為以下幾種類型：即 c-Kit+細胞、Sca-1+細胞、側群細胞、心肌球細胞、Islet1+細胞、心外膜衍生細胞等。其中：(1)c-Kit+細胞：發現最早，研究也最為深入，它表達許多心肌譜系標記，如GATA-4、Nkx2.5和MEF2，而不表達骨骼肌系、血細胞系及神經系的表面標記。生理狀態下，c-Kit+細胞靜止于心臟微環境中，與周圍支持細胞通過鈣黏素與鏈接蛋白相連，在機體衰老或損傷等內外源性刺激下，可遷移至損傷區域參與心臟修復與再生[10]。目前研究發現，c-Kit+細胞有肌源性和血管源性兩種亞型，肌源性主要分化為心肌細胞，而血管源性主要分化為內皮細胞；(2)Sca-1+細胞：不同于c-Kit+細胞的是，Sca-1+細胞同時也是造血系干細胞表面標記，可表達心臟結構基因(如肌球蛋白重鏈)，卻不表達Nkx2.5和編碼肌小節蛋白基因，在體內外具有一定克隆和增殖、分化潛能。(3)側群細胞：最初在一些成年器官中發現，隨后在新生小鼠心臟中也發現了這類細胞，并被證明具有干細胞樣特征和心肌細胞分化潛能。有研究認為ABCG2是心臟側群細胞表型的決定因素。但到目前為止，尚無報道提示側群細胞具有克隆性和自我更新能力，故其特性還需進一步研究。(4)心肌球細胞與心臟球形干細胞(cardiosphere-derived cells CDCs)，心肌球細胞意為多種CSCs的混合體，心臟組織在體外貼壁培養時可形成聚集為團狀的細胞而得名，其中c-Kit+細胞為心肌球細胞核心，周圍環繞CD105+支持細胞及豐富的Ⅳ型膠原。心肌球細胞經過傳代擴增后獲得的細胞單層稱為心肌球細胞衍生細胞。兩者均具有克隆性和多向分化潛能，且在Ⅰ期臨床試驗中(CADUCEUS)發現，心肌梗死患者冠狀動脈輸注CDCs治療與常規治療組比較，心肌梗死面積明顯減小，心功能得以改善[11]。

3CSCs修復梗死心肌的機制

目前大量嚙齒類動物實驗和Ⅰ期臨床試驗(SCIPIO和CADUCEUS)均顯示急、慢性心肌梗死和缺血性心肌病時，通過冠狀動脈輸入或者心肌內注射 CSCs可使心肌細胞再生，心肌梗死區心室壁厚度增加，瘢痕面積減少，左心室重構受到抑制，左心室射血分數提高，心臟功能改善，同時可調節梗死區心肌的電生理特性，減少心律失常的發生，治療效果良好[12-13]。然而CSCs在體內發揮心臟修復作用的機制目前各家報道不一。

3.1CSCs直接分化為功能心肌細胞

心肌缺血后再生壞死心肌細胞，建立有效的血運系統對保護心臟功能、改善遠期預后起關鍵作用。大量研究表明從大鼠心臟中分離的固有CSCs在某些生長因子作用下，可在體外誘導分化形成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，再生修復壞死心肌細胞，重建血運循環。

將體外培養擴增的CSCs注射到心臟的梗死區域，可形成大量新的心肌細胞[14]。Carr等[15]在新出生大鼠心臟組織中分離培養CDCs，并以綠色熒光蛋白(GFP)及氧化鐵標記，采用心肌內注射方法移植到梗死區后立即再灌注心肌，隨后繼續系統給予CDCs 2 d，16周后通過磁共振成像(MRI)檢測到GFP與氧化鐵標記的CDCs表達肌鈣蛋白I、血管性血友病因子和 平滑肌激動蛋白，大鼠心功能改善，且心肌梗死交界區域毛細血管密度增加，提示移植到心臟的CDCs分化成了心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞并形成新生血管。而成體小鼠心肌梗死后內源性CSCs可分化成心肌細胞和血管細胞，再生修復梗死心肌，實現心功能改善[16]。Ellison等[17]發表于2013年《Cell》雜志的一篇研究成果顯示90%CSCs處于休眠狀態，用異丙腎上腺素損傷心肌后，大部分CSCs即進入細胞周期，復制并定向分化為心肌細胞譜系，修復壞死心肌組織，實現其功能恢復作用，而骨髓衍生的c-Kit+細胞則沒有再生能力。然而，一些使用成年心肌固有CSCs的研究則報道了相反的結果：這些CSCs在體內水平不具備分化為心肌細胞的能力。對于這一爭議，Jop及其團隊的最新研究成果解釋了這一現象，他們將一種互補性DNA編碼Cre重組酶或他莫西芬(tamoxifen)誘導性MerCreMer嵌合體蛋白嫁接入小鼠的Kit基因位點，然后將這種小鼠與帶有報告基因品系的小鼠進行雜交，形成細胞帶有永久性標記的小鼠品系。這種品系小鼠心臟固有CSCs確實能產生出新的心肌細胞，只是所占百分比為3%。如考慮細胞融合的作用，則內源性c-Kit+細胞產生心肌細胞的百分率<0.8%。且在整個過程老年化，或是心臟受損情況下，其形成心肌細胞的百分率顯得更低，因此CSCs雖然可產生出心肌細胞，但這種作用可能在改善心臟功能方面并不具有顯著性[18]。更重要的是，目前鮮有CSCs分化為有功能心肌細胞的報道，大多數的研究成果僅發現誘導CSCs分化后，可表達心臟譜系細胞早期標志物，然而分化而來的細胞是否具有功能卻仍未明晰。

3.2CSCs旁分泌效應

隨著研究的不斷深入發現，雖然心肌受損后移植干細胞可通過直接分化作用改善心功能，但是由于干細胞分化的心肌細胞數量有限，不足以替補心臟受損丟失的細胞數量，因此，不能單純用直接分化機制解釋干細胞再生修復受損心肌的作用。有學者認為干細胞不但可直接再生心肌組織，而且還能通過旁分泌效應，增加細胞因子的表達，促進血管再生[19]。并有報道稱在心臟長期修復的過程中，CSCs間接的旁分泌作用強于其直接分化為心肌細胞的作用。例如：Tang等[20]在動物陳舊性心肌梗死模型中證實，移植的外源性 CSCs 不但可分化成心肌譜系細胞，而且還可通過旁分泌作用促進固有CSCs的增殖、分化，共同修復心臟組織，而且后者作用大于前者。

既往大量研究顯示在CSCs 體外培養過程中，可在其培養液中檢測出許多因子。根據其生物學特性，大致可分為三類：(1)血管發生相關因子，如血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子、β-成纖維細胞生長因子等，其中VEGF是血管發生強效因子，除誘導新生血管形成外，還能通過促進一氧化氮釋放，清除氧自由基等多途徑共同發揮保護心肌作用；(2)各種趨化因子，如SDF-1、SCF等，SDF與其配體CXCR4廣泛表達于多種組織細胞中，可趨化造血干細胞及內皮細胞形成有效新生血管，而SCF/c-Kit可活化c-Kit+細胞，并能維持其生物學功能；(3)炎癥相關因子，白介素-1、白介素-6等，白介素-6可通過誘導VEGF的產生，促進梗死心臟的修復。而研究既往認為胰島素生長因子-1可促進心肌生長，提高心肌收縮，抗細胞調亡以及促進梗死后的重建。

體內移植CSCs到急性心肌梗死的模型時，這些分泌的細胞因子同時參與 CSCs 的心肌再生和心臟的修復過程。它們可招募活化自身 CSCs，促進其遷移、生存、增殖、分化。還能促進血管新生和抗凋亡，同時能趨化其他細胞參與受損心肌的修復。從而減少瘢痕面積，改善心臟收縮、舒張期容積，抑制心室重構，改善心臟血流動力學水平，提高左室射血分數，從而修復心臟，改善心臟功能。CSCs 移植治療心血管疾病時直接和間接機制均起到了積極的作用[21-24]。在不需要CSCs輸注的情況下，治療性血管形成時給予CSCs所分泌的細胞因子逐漸成為人們的選擇。然而，CSCs旁分泌的細胞因子種類較多，功能復雜，目前還沒有證據表明某一種或幾種細胞因子在治療性血管形成中起決定性作用，其對損傷組織的修復作用很可能是各種細胞因子共同作用的結果，但機制不明。

對干細胞旁分泌作用的最新研究發現，在干細胞條件培養液中，存在一種納米級囊泡狀物質，即外泌體，其直徑為55～65 nm，對細胞之間的相互作用至關重要，可介導細胞間信息交流，參與機體組織多種病理生理反應，如抗原呈遞、免疫應答、遺傳信息交換、血管生成、炎癥及腫瘤轉移等。有研究證實心肌球細胞及CDCs均能分泌外泌體。動物實驗亦證實缺氧狀態下心臟祖細胞及其他干細胞通過旁分泌途徑分泌外泌體作用于受損心肌組織，并能有效減少小鼠急性心肌梗死后的梗死面積[25-26]。損傷細胞分泌含有細胞特異miRNAs的外泌體，干細胞內在化后可誘導其轉化為組織特征性的表型。外泌體也可由干細胞分泌，通過上調受體細胞中BCL2L1、BCL2和BIRC8等抗凋亡基因的表達及下調CASP1、CASP8和LTA等促凋亡基因的表達抑制損傷細胞的凋亡，促進細胞增殖和血管再生，促進組織的自身修復[27-28]。Chen等[21]發現心肌祖細胞的外泌體中富含miR-451，將心肌細胞與含該外泌體的培養基中共培養時發現，心肌細胞可以內化心臟祖細胞釋放的外泌體，并利用miR-451啟動細胞內信號通路而減少缺血-再灌注心肌細胞的凋亡，促進損傷細胞的修復。可見干細胞分泌的外泌體在細胞間進行信息傳遞，可通過旁分泌機制對受損組織進行修復。然而，不同細胞及體液來源的外泌體所包含的蛋白組分有所不同，此外，外泌體還含有大量遺傳物質，這些遺傳信息可通過在細胞間水平轉移的方式激活靶細胞產生一系列生物學效應。因此，探索與發現外泌體的功能作用成為今后干細胞治療的研究熱點。

3.3CSCs與其他干細胞類型相互作用

此外，心臟外源性干細胞與CSCs協同作用也可能是其發揮生物學功能的一個機制。如骨髓間充質干細胞所分泌的外泌體與c-Kit+細胞共培養后，可促進增殖、分化[29]。心肌梗死后移植骨髓間充質干細胞可通過激活內源性CSCs參與受損心肌細胞的更新和修復，最終減小梗死面積，改善左室射血分數。另有研究發現骨髓間充質干細胞可促進體內外環境中CSCs的增殖及分化潛能，在豬心肌缺血后再灌注損傷模型中，將 c-Kit+細胞和間充質干細胞聯合移植至梗死心肌區域，心肌梗死后14 d，通過心臟MRI分析顯示，兩種細胞聯合使用更能顯著提高CSCs的治療效能，減小梗死面積，改善心功能[30]。

4當前面臨問題及展望

對于CSCs移植治療仍處于初級階段，尚有許多問題需要解決：(1)CSCs在離體環境中如何維持其未分化狀態；(2)疾病或者衰老狀態是否影響CSCs的數量及心源性分化能力；(3)CSCs分化為心肌譜系細胞的確切機制至今仍未闡明，分化而來的細胞是否具有心肌細胞功能仍需進一步驗證。(4)CSCs釋放因子種類繁多，對組織修復的調控作用復雜多樣。此外，值得重點關注的是，隨著對miRNA的深入研究發現，其對于心血管譜系細胞的分化過程中具有重要調控作用，參與胚胎干細胞多能性維持，對胚胎干細胞向心肌起搏細胞分化發揮重要作用，但miRNA對于CSCs是否具有類似效應目前還未得知，因此這方面的可研究空間還很大。對于CSCs移植治療心肌梗死，仍有待細胞生物學對其機制的進一步研究，但干細胞療法仍然是今后研究的熱點，也是未來治療缺血性心臟病的趨勢所在。

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作者簡介：王艷(1988—)，碩士，主要從事冠狀動脈介入與再狹窄研究。Email：1321246876@qq.com 通信作者：石蓓(1964—)，教授，碩士，主要從事冠狀動脈介入與再狹窄研究。Email：shibei2147@163.com

【中圖分類號】R543.3

【文獻標志碼】A【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.03.027

收稿日期：2015-12-31修回日期：2016-01-28

Research Progress of Cardiac Stem Cells Repairing Infarction Myocardial Function Mechanism

WANG Yan1，SHI Bei1,2

【Abstract】Cardiac stem cells(CSCs) were found in the tissue of the mammalian heart has more than 10 years. During this time many of the studies have confirmed that CSCs can regenerate and repair infarcted myocardium and improve heart function. The researchers argue that CSCs play to the role of the repair infarcted myocardium mechanism may be related to its inherent characteristics including direct differentiation into functional myocardial cells. Through paracrine microenvironment of various cytokines, myocardial infarction area will be improved and angiogenesis promoted. In this paper, the current research mechanisms of CSCs that repair infarcted and the problems facing were reviewed in order to find a new direction and strategy for the development of transforming medicine and heart disease prevention.

【Key words】Cardiac stem cells;Exosome;Myocardial infarction;Regeneration treatments