間充質干細胞促進外傷性脊髓損傷修復的相關機制

鄒禮梁，王奎，陳健爾

間充質干細胞促進外傷性脊髓損傷修復的相關機制

鄒禮梁，王奎，陳健爾

據統計，全球每年有25～50萬人發生脊髓損傷（SCI）事件，年齡多在16～30歲[1]。根據其發病機理，脊髓損傷可分為原發性脊髓損傷和繼發性脊髓損傷，原發性脊髓損傷是不可逆的，繼發性損傷可通過干預手段如手術治療、藥物干預及干細胞移植等手段進行調控促進損傷的修復。然而，手術治療容易引起二次損傷，激素治療作用相對局限且不良反應較大。近年來，干細胞成為SCI治療的新選擇，尤其是間充質干細胞(MSCs)，其來源廣泛、取材便利、易于純化、細胞自我更新能力強、可多向分化且可自體移植，克服了倫理和免疫排斥等問題。MSCs促進SCI修復的作用機制也逐漸得到闡明，其可能相關機制主要有干細胞的替代填充機制，抑制細胞凋亡、調節細胞自噬機制，調節炎癥、改善局部微環境機制、促進血管新生機制以及促進軸突抽芽生長機制等方面。本研究擬闡述MSCs促進SCI修復的作用機制，報道如下。

1 細胞填充、替代作用促進SCI修復

MSCs在SCI部位具有填充脊髓空洞和替代受損組織作用。Boido等[2]通過形態測定分析顯示MSCs移植組的脊髓壞死灶體積與對照組相比縮小了31.6%，并發現遷移至損傷區域的MSCs能穿透膠質囊性區，逐步填充脊髓空洞區域，替代受損組織，抑制損傷部位囊性空洞的繼續形成。顧衛東等[3]報道SCI模型MSCs移植組相對PBS注射組，其脊髓空洞體積顯著縮小，脊髓殘存白質的面積明顯偏大且受損脊髓的病理改變也得到明顯改善。這可能與MSCs具有多向分化的潛能，能在脊髓微環境的作用下定向分化為神經元樣細胞和星形膠質細胞等特定的神經組織有關[4]。因為這些定向分化為神經元樣的細胞聚集和填充于脊髓囊性病變區后，可在一定程度上替代損傷或壞死的神經組織，抑制損傷區囊性空洞的繼續形成，從而促進脊髓功能的恢復[2]。

2 抑制細胞凋亡和調節細胞自我吞噬

脊髓發生損傷后會引起受損部位細胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）和細胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性死亡），這也阻礙神經的修復和脊髓功能的恢復。而Jun-Lin等[5]報道植入體內的MSCs可通過抑制細胞凋亡和調節細胞自我吞噬保存殘留的神經組織，為脊髓的修復提供一定的物質基礎。

2.1 抑制細胞凋亡MSCs能合成和分泌抑制細胞凋亡的蛋白質，比如B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、生存蛋白和蛋白激酶B（Akt）等[6]。其中Bcl-2是調控細胞凋亡的關鍵蛋白，它可抑制細胞凋亡蛋白酶活化劑的釋放，從而減少細胞凋亡。MSCs除了能合成直接抑制細胞凋亡的蛋白質，還能分泌血管內皮生長因子（VEGF），介導局部黏著斑激酶（FAK）磷酸化參與抗細胞凋亡過程。

2.2 調節細胞自我吞噬細胞自我吞噬具有兩方面的含義：（1）細胞自噬觸發細胞死亡程序導致細胞死亡，即細胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性細胞死亡），多是由傷害性因素引起，如細胞結構的破壞；（2）細胞通過自噬現象保持細胞的自我更新和分化能力，即細胞干性的保持（程序性細胞存活），主要由內源性因素引起，如細胞的衰老和組織的再生[7]。細胞自我吞噬可表達兩個重要標志物：微管相關蛋白輕鍵3B和自噬基因Beclin-1[8]。輕鍵3B與Beclin-1均參與自噬體的形成，可用于檢測細胞自噬行為[9]。Yin等[10]報道在脊髓缺血或缺血再灌注損傷大鼠的脊髓中輕鍵3B和Beclin-1出現高表達現象，而MSCs移植后輕鏈3B和Beclin-1的表達出現明顯的減弱，可見脊髓損傷后自噬體形成增多，而MSCs移植后自噬體的形成減少，降低了細胞自我吞噬的發生，從而有利于保存損傷區域的神經組織，為脊髓修復提供物質基礎。

3 調節炎癥反應，改善局部微環境

SCI后血脊髓屏障被破壞，炎癥細胞聚集，中性粒細胞和巨噬細胞隨同常駐的小膠質細胞趨化浸潤，從而產生質金屬蛋白酶（MMPs）以及其他水解蛋白酶和氧化酶、前炎性細胞活素，局部微環境進一步被破壞[11]。

MSCs植入體內后自身可分泌多種神經營養和生長因子[腦源性神經營養因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）及膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）等]，抵抗NO介導的谷氨酸神經細胞毒性，保護神經元免受細胞毒性侵害；調節自由基代謝，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等在神經元內的含量，減少自由基積聚，保護神經元免受自由基的攻擊[12]。BDNF還可協同NGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等生長因子，刺激MSCs分化為神經樣細胞，更進一步促進BDNF等營養因子的分泌[13]，改善受損部位微環境，促進神經組織修復。

Urdzíková等[11]發現，大鼠經鞘內移植MSCs后腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素4（IL-4）、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的水平相對減少，而巨噬細胞炎癥蛋白-1（M IP-1）和依賴激活正常T細胞表達分泌的調節蛋白（RANTES）的水平有所增加，有效地減少炎癥反應，而且多次重復植入干細胞能維持干細胞在損傷處產生的抗炎癥反應等積極作用。此外，Lynch等[14]報道，損傷部位的小膠質細胞活化后，其細胞形態常表現為突起回縮，胞體相對增大乃至呈巨噬細胞樣能采用阿米巴樣的運動形式移向損傷區域，充當吞噬細胞的作用，清除凋亡細胞碎片，減輕炎癥反應，但其移行機制目前仍不清楚。

4 促進SCI區域血管新生和血管重建

血管生成在SCI修復作用機制中起著關鍵性作用[15]。SCI后神經纖維的再生，突觸的重建，組織的修復和功能的恢復，都需要血液的供應和營養的支持[16]。MSCs主要是通過分泌VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和bFGF等促進脊髓損傷處的血管新生，穩定血管網絡[17]。

4.1 VEGF VEGF作為一種多功能細胞因子，能促使血管內皮細胞增殖、分化、遷移及存活，促進血管新生和血管重建[18]。Hyuk等[19]將VEGF和PBS分別注入兩組大鼠體內，并通過測量血管假血友病因子（vWF）陽性血管密度來確定血管生成的程度，結果發現VEGF顯著增加了SCI區域vWF陽性血管的密度，而且是PBS組的5倍多，這表明VEGF可明顯促進SCI區域血管的生成。VEGF主要是與內皮細胞表面的VEGF受體-1（VEGFR-1）和VEGFR-2結合激活胞內酪氨酸激酶，并通過觸發下游多種信號通路促進血管新生[20]；從而改善損傷區域微循環，促進神經功能恢復。

4.2 bFGF bFGF具有促進內皮細胞分裂、增殖和分化，促進血管新生等生物學作用。馬秀現等[21]報道bFGF能促進成纖維細胞、血管內皮細胞和上皮細胞快速增殖和分化，促使微血管生長分化，增加局部毛細血管數量。Toshihiro等[22]報道，bFGF較VEGF更顯著地促進了血管平滑肌細胞的生長，但相比而言也更容易引起血管炎癥反應。

4.3 Ang-1 Ang-1是一種分泌性的蛋白分子，可促進胞漿素及基質金屬蛋白酶2（MMP2）的分泌，激活絲氨酸蘇氨酸蛋白酶AKT，穩定細胞活力，抑制內皮細胞凋亡，減少血管的萎縮和退化，穩定血管網絡[23]。為組織提供血液和營養支持，改善損傷組織微環境從而促進SCI傷口恢復。Herrera等[24]報道SCI后（6 h內）Ang-1表達顯著下降可能與脊髓損傷后大量Ang-1被用來代償損傷部位低蛋白水平，修復和穩定損傷區域血管等密切相關。Herrera等[25]通過核磁共振成像(MRI)觀察發現聯合應用VEGF和Ang-1后，SCI病灶體積明顯縮小，而且SCI區域血管網絡的穩定得到維持。

此外，MSCs還自分泌或旁分泌神經營養因子-3（NT-3）、IL-6、轉化生長因子-（TGF-)等細胞營養和生長因子，具有促進細胞增殖、分化及存活等生物學意義。

5 促進SCI區域神經軸突抽芽和生長

顧衛東等[3]通過脊髓埋管實驗發現，種有MSCs的導管中可見有新生軸突長入，未種MSCs的導管中沒有發現軸突生長。Yin等[10]通過免疫組織化學和免疫熒光檢測方法發現，與未植入MSCs的大鼠相比，已植入MSCs的大鼠的軸突再生標志物、神經元標志物、生長相關蛋白-43（GAP-43）和微管相關蛋白2（MAP-2）表達都明顯增高。這都說明了MSCs具有促進神經軸突抽芽生長的作用。Liu等[26]通過對MSCs進行bFGF基因轉染后移植到急性脊髓損傷的大鼠中發現，經過bFGF基因轉染后的MSCs可以大量分泌bFGF等生長因子，有效地促進脊髓損傷區域軸突的抽芽再生，有利于大鼠脊髓損傷后神經功能的恢復。此外，MSCs還能合成細胞外基質成分，如層黏連蛋白、纖維連接蛋白，為組織提供營養和結構支持，引導軸突的生長，支持軸突再生，修復脊髓損傷區域[27]。

此外，脊髓受到損傷后，脊髓組織中一些對生長錐起負效應的蛋白或因子的表達出現上調，不利于軸突的抽芽和生長[28]。而MSCs分泌的多種細胞因子可以在一定程度上拮抗神經生長抑制因子，逆轉NO介導的谷氨酸細胞毒性，減少自由基積聚，保護神經組織免受細胞毒性和自由基的侵害。

6 展望

MSCs在促進外傷性SCI修復方面具有非常廣闊的應用前景，但我們對其各種修復機制的研究與認識尚存在一些問題和不足：（1）MSCs自/旁分泌對脊髓損傷區域微環境改變的相關機制還沒有統一的定論；（2）MSCs移植至體內后，機體內的相關因子或蛋白是如何對干細胞的存活、增殖和分化進行調控；（3）目前機制研究主要以單一疾病模型的動物為研究對象，而MSCs在人體內的相關機制將更為復雜，需要更進一步的臨床評估與研究。此外，MSCs植入受損機體的最佳時間、最優植入途徑，以及移植治療的臨床安全性仍有待在動物實驗和臨床實驗中做進一步的研究。只有明確了MSCs在不同的時間點通過不同的移植途徑植入機體后對機體微環境造成的影響，明確微環境出現各種變化的機制原理，才能確保臨床應用的安全性和效用的最大化，進而科學地指導和推進MSCs的臨床應用。

[1]Von-Groote PM,Shakespeare T,Officer A.Prevention of spinal cord injury[J].Inj Prev,2014,20(1):72-73.

[2]Boido M,GarbossaD,FontanellaM,etal. Mesenchymal Stem Cell Transplantation ReducesGlialCystand ImprovesFunctional Outcome A fter SpinalCord Compression [J].World Neurosurg,2014,81(1):183-190.

[3]顧衛東,于布為,張富軍,等.骨髓間充質干細胞移植促進脊髓損傷修復的機制[J].中華創傷雜志，2012,28(6):550-555.

[4]TsaiHL,ChiuWT,Fang CL,etal.Different forms of tenascin-C with tenascin-R-regulateneuraldifferentiation inbonemarrow-derived humanmesenchymalstem cells[J].TissueEngPartA,2014,20(13):1908-1921.

[5]Jun-Lin G,Anna KS,Mark P,etal.Autophagy in stem cells[J].Autophagy,2013，9 (6):830-849.

[6]Wang SP,Wang ZH,PengDY,etal.Therapeutic effectofmesenchymalstem cells in rats with intracerebralhemorrhage:Reduced apoptosisandenhanced neuroprotection [J].MolMed Report,2012,6(4):848-854.

[7]PanHZ,CaiN,LiM,etal.Autophagic controlofcell"stemness"[J].EMBOMolMed, 2013,5(3):327-331.

[8]ChoiJ,JungW,Koo JS.Expressionofauto phagy-relatedmarkers beclin-1,light chain 3A,lightchain 3B and p62 according to the molecularsubtypeofbreastcancer[J].Histopathology,2013,62(2):275-286.

[9]M iracco C,CeveniniG,Franchi A,etal. Beclin1and LC3autophagicgeneexpression in cutaneousmelanocytic lesions[J].Human Pathology,2010,41(4):503-512.

[10]Yin F,Meng Cy,Lu Rf,etal.Bonemarrow mesenchymalstem cells repairspinalcord ischemia/reperfusion injury by promoting axonalgrow thand anti-autophagy[J].Neural Regen Res,2014,18(9):1665-1671.

[11]UrdzíkováLM,R i ka J,BagnaraML, etal.HumanMesenchymalStem CellsModulate Inflammatory Cytokines after Spinal Cord Injury in Rat[J].Int JMolSci,2014, 15(7):11275-11293.

[12]LinWw,LiM,LiY,etal.Bonemarrow stromal cells promote neurite outgrow th of spinal motor neurons by means of neurotrophic factorsinvitro[J].NeurolSci,2014,35(3):449-457.

[13]Zemelko VI,Kozhucharova IB,Alekseenko LL,etal.Neurogenic potential of human mesenchymalstem cells isolated from bone marrow,adipose tissueand endometrium: a comparative study[J].Cell Tissue Biol, 2013,7(3):235-244.

[14]Lynch MA.Themultifaceted profileof ac tivatedm icroglia[J].MolNeurobiol,2009, 40(2):139-156.

[15]Reginato S,Gianni-BarreraR,BanfiA.Tamingof thewild vessel:promotingvesselstabilization for safe therapeutic angiogenesis [J].BiochemicalSociety Transactions,2011, 39(6):1654-1658.

[16]Kundi S,Bicknell R,Ahmed Z.The role of angiogenic and wound-healing factors afterspinalcord injury inmammals[J].NeurosciRes,2013,76(1-2):1-9.

[17]Deng YB,YeWB,Hu ZZ,etal.Intravenouslyadministered BMSCsreduceneuronal apoptosisand promoteneuronalproliferation through the releaseofVEGFafterstroke in rats[J].NeurolRes,2010,32:148-156.

[18]Prasadam I,Zhou Y,Du Z,etal.Osteocyteinduced angiogenesis via VEGF-MAPK-dependentpathways inendothelialcells[J]. Molecularand CellularBiochemistry,2014, 386(1-2):15-25.

[19]Hyuk MK,Dong HW,Jong EL,etal.Ex vivo VEGF delivery by neural stem cells enhancesproliferation of glialprogenitors, angiogenesis,and tissue sparing after spinalcord[J].Injury,2009,4(3):1-10.

[20]Beck H,Plate KH.Angiogenesisafter cer ebralischemia.ActaNeuropathol[J].2009, 117:481-496.

[21]馬秀現,王志偉,李楓.堿性成纖維細胞生長因子促進兔缺血后肢血管新生的實驗研究[J].中國現代普通外科進展,2006,9 (6):333-336.

[22]Toshihiro K,Hirokazu K,Makoto S,etal. Hepatocytegrow th factorstimulatedangiogenesis without inflammation:Differentialactionsbetweenhepatocytegrow th factor,vascularendothelialgrow th factorand basic fibroblastgrow th factor[J].Vascular Pharmacology,2012;57(1):3-9.

[23]Kim I,Kim HG,So JN,etal.Angiopoietin1 regulatesendothelialcellsurvival through thephophatidylinositol3 kinase/aktsignal transduction pathway[J].Circ Res,2000, 86(1):24-29.

[24]Herrera JJ,Nesic T,Narayana PA.Reduced vascular endothelial grow th factor expression in contusive spinalcord injury[J]. JNeurotrauma,2009,26:995-1003.

[25]Herrera JJ,Sundberg LM,Zentilin L,etal. Sustained ExpressionofVascularEndothelialGrow th Factorand Angiopoietin-1 ImprovesBlood-SpinalCord Barrier Integrity and FunctionalRecovery afterSpinalCord Injury[J].Journal Of Neurotrauma,2010, 27:2067-2076.

[26]LiuWG,Wang ZY,Huang ZS.Bonemarrow-derivedmesenchymal stem cells expressing thebFGF transgenepromoteaxon regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats[J].Neurological Research,2011,33(7):686-693.

[27]W rightKT,ElMasriW,Osman A,etal.Bone marrow for the treatmentofspinalcord injury:mechanismsand clinicalapplications [J].Stem Cells,2011,29(2):169-178.

[28]張文彬,周琴,林斌.脊髓損傷后軸突再生抑制機制的研究進展[J].中國脊柱脊髓雜志,2014,24(10):946-949.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.076

R651.2

C

1671-0800(2016)10-1404-03

2015-06-17

（本文編輯：鐘美春）

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2012C33066）；浙江省中醫藥科技計劃項目（2012ZA123）

310053杭州，浙江中醫藥大學

陳健爾，Email:cje28@foxmail.com