結核性胸腔積液的實驗室檢查進展

李微蕾綜述，鄭輝才審校

（海南省第三人民醫院呼吸內科，三亞572000）

結核性胸腔積液的實驗室檢查進展

李微蕾綜述，鄭輝才△審校

（海南省第三人民醫院呼吸內科，三亞572000）

胸腔積液/診斷；結核，胸膜；實驗室技術和方法；綜述

正常情況下，健康人胸膜腔的臟層胸膜與壁層胸膜之間存在一個潛在的腔隙，其中有少量（30～50 mL）潤滑液起著潤滑作用，其產生和吸收處于一種平衡狀態。胸膜腔內出現過多液體被稱為胸腔積液。在引起胸腔積液的原因中，結核性胸膜炎（tuberculous pleurity，TP）是我國滲出性胸腔積液最常見的病因，其發病機制是結核分枝桿菌直接侵犯胸膜或機體對結核桿菌的遲發性超敏反應［1］。據世界衛生組織（WHO）報道，2015年全球估計共有960萬例結核病新發病例，我國有93萬例，為結核病高負擔國家之一，其中包括TP患者。該類患者在臨床上表現為結核中毒癥狀，如午后潮熱、盜汗、疲乏無力、體質量降低等，常以單純胸腔積液表現而就診，導致早期臨床上難以鑒別。所以，早期快速、簡便的診斷方法對明確胸腔積液性質具有重要意義。明確結核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion，TPE）的診斷需要在胸腔積液或胸膜活檢組織中找到結核分枝桿菌，但傳統的診斷方法，如結核分枝桿菌涂片抗酸染色和結核分枝桿菌分離培養存在檢出率低、周期長等局限性，而胸膜活檢和胸腔鏡檢查因其有創性使其臨床應用受限。故選擇靈敏、特異、有效的實驗室檢查方法是協助診斷TPE的重要手段。本文就TPE的病原學、免疫學、生物化學和分子診斷等實驗室檢查方法的研究進展進行綜述。

1　病原學檢查

胸腔積液中找到結核分枝桿菌有助于病原診斷，是診斷TPE的“金標準”，包括結核分枝桿菌涂片染色法和結核分枝桿菌培養法。

1.1結核分枝桿菌涂片染色法涂片染色檢查除了常采用的齊爾-尼爾森染色法外，還有熒光顯微鏡抗酸桿菌檢測法，但陽性率很低，涂片染色法結核分枝桿菌檢出率為0%～25%［2］。徐進等［3］應用涂片、漂浮集菌、超聲萃取3種方法檢測結核分枝桿菌，陽性率分別為3.04%、8.66%、16.56%，超聲萃取法檢出率明顯高于直接涂片法和漂浮集菌法。涂片染色法簡單、快速、易行，但是靈敏度低，無特異性，涂片陽性只能說明胸腔積液中含有抗酸桿菌，不能區分結核分枝桿菌與其他分枝桿菌，且無法鑒別死菌與活菌。

1.2結核分枝桿菌培養法該法常作為結核病診斷的“金標準”，且培養陽性菌株的藥敏試驗結果是指導TP治療的依據，目前的培養方法主要有羅氏培養法和快速培養法［4］。胸腔積液培養陽性至少需要10～100個活菌，培養周期為2～8周，其培養陽性率僅為8.5%～38.3%［3］。因此，基于傳統培養方法的改良培養方法對提高陽性率尤為重要。杜博平等［4］建立了一種TPE的培養新方法，接種TPE后，含復蘇因子（Rpf）的7H11培養基Rpf培養組較改良培養基可提高結核分枝桿菌的培養陽性率（43.5%），而傳統改良羅氏培養組陽性率僅為16.1%，縮短了培養時間，Rpf培養組陽性結果報告時間較改良羅氏培養組提前近20 d。而快速培養法培養條件要求高，容易受臨床使用抗生素的影響，儀器和培養基價格昂貴，難以在基層醫院普及。因此，無論是哪種培養方法，培養周期長均不利于臨床早期快速篩查。

2　免疫學檢查

2.1結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）TST是基于遲發型變態反應原理的一種皮膚試驗，是從結核菌的液體培養基中提取結核蛋白注射于皮內48～72 h內，依據是否發生變態反應出現硬結，判斷是否感染結核分枝桿菌，并非檢出結核病。TST是一項敏感度高、特異度強的檢查方法。李月翠等［5］的試驗結果顯示，TST的敏感度為51.3%，特異度為66.9%。TST反應陽性對診斷結核感染有重要價值，但結核菌感染存在窗口期，即結核菌感染后需4～8周變態反應才能充分建立，所以，在感染初期，結核菌素試驗可為陰性。另外，老年人、嚴重結核患者、營養不良、免疫力低下者（如艾滋病、白血病、淋巴瘤、使用免疫抑制劑等），TST也可呈假陰性。由于許多國家和地區廣泛推行卡介苗接種，TST陽性不能有效區分是結核分枝桿菌的自然感染還是卡介苗接種引起的免疫反應，只有3歲以下嬰幼兒且沒有接種過卡介苗者TST陽性才能提示有活動性病灶［6］。所以，在卡介苗高接種率地區，TST對檢測是否感染結核分枝桿菌受到了很大限制。

2.2結核抗體檢測結核抗體是機體對結核菌或菌體成分發生特異性免疫應答的產物，檢測的抗體類型包括IgG、IgA、IgM，常用方法包括結明試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫斑點試驗、蛋白質芯片技術等［7］。結核抗體檢測主要用于活動性結核感染的確診，以彌補病原學檢測靈敏度過低的問題［8］。劉倩穎等［9］使用高純度特異度抗原脂阿拉伯甘露糖在活動性肺結核患者中檢出結核抗體的陽性率為72.67%，高于涂片法和TST。也有研究表明，IgG/IgM抗體聯合檢測及多克隆抗卡介苗IgM抗體檢測，其陽性預測值可高達96%［10-11］，而且對于單純性TP，胸腔積液結核抗體檢出陽性率高于血結核抗體的陽性率，血結核抗體陰性而胸腔積液結核抗體陽性，則強烈支持TP的診斷［12］。血清抗體檢測雖然是結核特異度免疫應答指標，但是引起免疫應答的抗原性比較復雜，與其他菌屬存在交叉反應，而且受年齡、抗體類型、結核病類型和卡介苗接種的影響［8］，所以應結合其他輔助診斷進一步分析。

3　生物化學檢查

3.1腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）ADA廣泛分布于人體胸腺、脾臟、淋巴結等組織中，尤其在淋巴細胞中含量較高，其參與人體淋巴系統核酸代謝。結核桿菌及菌體成分在感染機體的過程中被T淋巴細胞介導的巨噬細胞吞噬，分泌細胞因子和炎癥介質，在炎癥發展過程中，T淋巴細胞遭到破壞，釋放出大量ADA［13］。1979年Piras等［14］首次報道了TPE患者ADA水平顯著增高，為胸腔積液的鑒別診斷和TP的診斷提供了依據。胸腔積液中ADA水平明顯增高，超過免疫功能受抑制的惡性腫瘤的漿膜積液及漏出液中的ADA［13］，所以胸腔積液中ADA水平是目前診斷與鑒別TPE的重要指標。ADA臨界值的界定對胸腔積液的鑒別診斷尤其重要，以往國內常以胸腔積液ADA水平大于45 U/L作為TP的診斷標準，ADA診斷TP的敏感度為71.4%，特異度為94.0%［15］；但尉艷霞等［16］研究發現，以ADA臨界值為45U/L，診斷TP的敏感度僅為44.9%，特異度為100.0%，敏感度低的原因可能是炎癥早期或機體免疫功能減退（如患艾滋病等）所致；將ADA界定在28.7 U/L，靈敏度則上升至75.5%，特異度為95.2%，其特異度下降可能與患有類肺炎性胸腔積液、類風濕關節炎等有關。有研究顯示，胸腔積液中ADA水平大于70 U/L，則高度提示結核；反之，如果ADA水平小于40 U/L，則基本上可以排除結核，因為對于淋巴細胞豐富的胸腔積液，如類風濕關節炎、支氣管肺泡癌、間皮瘤、支原體和衣原體性肺炎、鸚鵡熱、肺吸蟲病、感染性單核細胞增多癥、普魯菌病、地中海熱、組織胞漿菌病、球孢子菌病，以及大多數膿胸患者，其胸腔積液ADA也可增高［17］。診斷閾值下降可增加診斷的靈敏度，但同時也降低了特異度；反之，增加診斷的特異度，勢必以減少靈敏度為代價。

ADA診斷的敏感度和特異度不僅取決于檢測結果本身，還與多種因素相關，在臨床上也要考慮以下因素，才能得到更準確的結果。（1）結核病的流行程度［18］：在結核病高流行區，ADA的診斷閾值升高，在結核病低流行區，降低ADA閾值可以保持較高的陰性預測值；（2）年齡因素：年齡與胸腔積液ADA水平呈負相關，隨著年齡的增長，機體免疫功能逐漸下降，淋巴細胞增殖能力減弱，釋放ADA減少，所以，高齡人群采用ADA診斷TP的靈敏度較低，漏診的可能性大［19］。單純胸腔積液ADA測定雖然為臨床提供了很大幫助，但是疾病的診斷不能只靠單一指標，需聯合多種實驗室檢測指標才能得出最后診斷。

3.2γ-干擾素近年來，在有關TPE細胞因子的研究中，γ-干擾素受到的關注越來越多。γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）是檢測結核病的一種免疫學方法，其原理是機體感染結核桿菌后產生相應具有抗原特異性的致敏T淋巴細胞，特別是CD4+T細胞，當特異性T淋巴細胞再次接觸結核桿菌特異性抗原后被激活，迅速活化增殖，分泌γ-干擾素［20］。在此原理的基礎上，用結核桿菌特異性抗原如早期分泌性靶抗原6（6-kDa early secretory antigenic target，ESAT-6）和濾液培養蛋白10（10-kDa culture filtrate protein，CFP-10）在體外與患者外周全血、外周血淋巴細胞或胸腔積液淋巴細胞進行檢測，后二者稱為結核感染T細胞斑點試驗（T cell enzyme-linked immunospot tuberculosis test，T-SPOT. TB），通過酶聯免疫斑點試驗可定量檢測γ-干擾素釋放水平（即斑點水平），判斷有無結核桿菌感染［21］。

陳希等［22］的研究結果顯示，T-SPOT.TB的敏感度和特異度分別為91.67%和91.11%，診斷準確率為94.62%，其檢測ADA的敏感度和特異度高于血清結核抗體及胸腔積液檢測結果，表明T-SPOT.TB檢測外周血ADA對TP的早期診斷具有較高的應用價值。Wilkinson等［23］通過比較10例TP、8例癌性胸腔積液檢測結果證實，胸腔積液中分泌γ-干擾素的單個核細胞檢測比外周血具有更高的敏感度和特異度。江靜等［24］指出，γ-干擾素測定診斷TP的總靈敏度（89%）和總特異度（97%）均較高，測定胸腔積液中γ-干擾素含量有助于診斷TP。石慧等［25］取外周血及胸腔積液同時行T-SPOT.TB檢測，結果表明，外周血診斷TP的敏感度為88.9%，特異度為83.3%，而胸腔積液診斷TP的敏感度更高，達100.0%，這可能與TP患者胸膜腔內局部免疫增強，效應T細胞向胸腔積液轉移有關；該研究還對TP組患者進行了3個月的規律抗結核治療，隨診后再次行外周血T-SPOT.TB檢測，發現其斑點形成細胞數出現下降趨勢，說明外周血T-SPOT.TB檢測可用于評估療效及監測病情活動，即如果斑點數在短時間內顯著增加，則提示體內結核活動［26］，可為臨床抗結核治療效果評估提供依據。

大部分研究對入組對象的選擇會排除免疫低下（如患艾滋病、使用免疫抑制劑等）、營養不良等因素，以減少對檢測結果的影響，但往往這些免疫低下、營養不良的患者更容易合并結核病。張麗帆等［26］通過對國外多項數據的研究表明，年齡、人類免疫缺陷病毒感染狀態和營養不良對T-SPOT.TB結果無影響，但在嬰幼兒的研究結果中，T-SPOT.TB的敏感度僅為50%，說明嬰幼兒運用T-SPOT.TB診斷結核的敏感度會降低。T-SPOT. TB主要針對ESAT-6和CFP-10進行檢測。鄭春華等［27］報道，1996年Mahairas將在結核桿菌上發現的一段基因序列命名為“RD1”，ESTA-6和CFP-10均來自RD1區，而且只有結核分枝桿菌存在RD1區，所有卡介苗和大多數環境分枝桿菌都缺失該區域［21］。所以，T-SPOT.TB不受卡介苗及其他致病性非結核分枝桿菌的干擾，在我國卡介苗高接種地區檢測意義較大。

結核感染可以分為潛伏性結核和活動性結核，機體免疫力低下時，結核桿菌大量復制增殖，從而導致結核活動。目前還沒有直接診斷潛伏性結核的方法，主要依靠TST和γ-干擾素釋放試驗來協助診斷，國內也缺乏對潛伏性結核發病的大規模前瞻性研究。阮巧玲等［28］通過6年的前瞻性隨訪研究指出，活動性肺結核患者的家庭接觸者進展為活動性結核的年發病率為1.1%（11/ 1 000），即每年每1 000個家庭接觸者中有11人發病，與中國一般人群中結核病年發病率73/10萬相比，家庭接觸者發展為活動性結核病的風險顯著升高，表明T-SPOT.TB與TST預測活動性結核病的能力相仿，TSPOT.TB檢測與活動性結核病的發生關聯程度弱。王睿等［29］基于國外的多項臨床研究報告提出，IGRA和TST在診斷潛伏性結核感染的應用價值大致相當，與阮巧玲等［28］研究結論一致，但在IGRA診斷活動性肺結核、肺外結核及IGRA評價抗結核治療效果3個方面提出疑問，與國內研究結果不同的是，該報告指出T-SPOT.TB對于診斷活動性肺結核的價值不大，IGRA對診斷TP沒有應用價值，在評價抗結核治療方面的作用有限。作者認為，有關IGRA的論文大部分是發達國家的臨床研究報告，與我國的結核高負擔現狀存在差異，需進行大規模前瞻性研究進一步評價IGRA在我國的應用價值［29］。3.3C反應蛋白（C-reactionprotein，CRP）CRP是一種環狀五球體蛋白，廣泛分布于胸腔積液、腹水、心包積液和血液中，感染時CRP水平會顯著升高，反映機體急性炎癥狀態，不受年齡、性別、血紅蛋白水平等因素的影響，是TP的一項輔助診斷指標。唐軍［30］對60例TPE和60例癌性胸腔積液的檢測結果顯示，結核組患者胸腔積液中CRP為（13.6±3.1）mg/L，腫瘤組為（8.6±2.2）mg/L，結核組CRP陽性率為91.67%，腫瘤組為6.67%，提示以CRP水平大于11 mg/L為診斷標準，CRP診斷TPE的特異度為91.67%。但由于CRP為廣泛存在的急性時相反應蛋白，需排除其他可能感染后才能進行鑒別診斷。

3.4其他生化指標TPE中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、IL-2及sIL-2R、IL-6、IL-27、CA125、D-二聚體等生化指標均可升高。有研究顯示，多項指標聯合檢測能提高診斷TP的靈敏度。但是所有的生化指標都缺乏特異度，需要多種指標聯合檢測，并結合臨床和其他檢查才能確診。

4　分子診斷

WHO推薦了2種分子生物學技術，即DNA探針和實時熒光定量PCR。

4.1DNA探針DNA探針技術是用結核分枝桿菌DNA片段直接在硝酸纖維膜上點樣，包括全染色體DNA探針、克隆DNA片段和寡核苷酸探針等，與固定在硝酸纖維膜上的DNA進行雜交，同時用放射性或生物素標記，經顯色后觀察結果。但因其靈敏度不夠高，需聯合DNA指紋、DNA測序等其他技術，操作復雜，在臨床上難以開展。

4.2實時熒光定量PCRPCR是選用一對特定的寡核苷酸引物介導的結核菌某特定核酸序列的DNA體外擴增技術，現有巢式PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR等。自2010年底開始，WHO推薦將結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert my cobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF）作為結核病及利福平耐藥結核病的主要診斷工具，Xpert MTB/RIF以半巢式及實時熒光定量PCR為技術基礎，不但可以診斷結核病，還可進行菌種復合群檢測及耐藥檢測。賈留群等［31］采用Xpert MTB/RIF對肺外結核的診斷價值進行了meta分析，結果顯示，Xpert MTB/RIF對TPE的敏感度為0.32（95%CI 0.20～0.47），特異度為1.00（95%CI 0.91～1.00）。可以看出，Xpert MTB/RIF對診斷TPE的敏感度欠佳，但是具有較高的特異度，對診斷TPE有一定價值。

5　小結與展望

要達到全球終止結核病的目標，需要在診斷方法上采取特異度與敏感度更高且更安全、更方便的診斷技術及有效的治療手段，但由于基層醫院條件、能力、資源等因素制約，阻礙了先進檢測方法的開展。單一的實驗室檢測方法敏感度不一致，如結核菌涂片檢查的檢出率為0.0%～25.0%，胸腔積液培養陽性率為8.5%～38.3%，TST的敏感度為51.3%，ADA檢測敏感度為71.4%，IGRA敏感度可達88.9%，但由于各項檢測指標受多種因素的影響，特異度不一，所以會導致誤診、漏診的發生，因此，多種實驗室指標聯合檢測對TP的診斷準確性較高［32］。2015年全球結核病報告指出，一種新的診斷平臺Gene Xpert Omni?正在開發，預計比現有的分子診斷技術將更小巧、輕便和便宜，為基層醫院獲得準確、快速的診斷帶來福音。

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（2016-05-12）