白色杜洛克×二花臉資源家系豬血液性狀的系統遺傳學研究

徐　盼，張　震，崔磊磊，楊　斌，段艷宇

(江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，南昌 330045)

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白色杜洛克×二花臉資源家系豬血液性狀的系統遺傳學研究

徐盼，張震，崔磊磊，楊斌，段艷宇*

(江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，南昌 330045)

摘要：為揭示家豬血細胞性狀的遺傳基礎，本研究整合白色杜洛克×二花臉豬F2資源家系肌肉血細胞性狀eQTL和全基因關聯分析結果，鑒別影響血細胞性狀的候選基因。研究測定了1 149個個體的18種血常規和593個個體肌肉轉錄本表達水平，對1 020個個體進行基因分型。轉錄組表達水平與血常規數據的關聯性使用斯皮爾曼系數進行評估，將血細胞性狀相關聯的轉錄本進行eQTL定位并進行基因富集分析，結合前期本試驗的GWAS結果進行綜合分析。結果，當P<5×10-4時檢測到血細胞相關的eQTLs有122個，其中有9個順式eQTLs和63個反式eQTLs。通過eQTL定位確定SERPINB6為影響紅細胞性狀的候選基因，基因富集分析鑒別到影響紅細胞性狀的候選基因為PTPRC和ITGA8，GWAS和eQTL的綜合分析發現影響紅細胞性狀相關的基因為TMED9、PCK1、TINAGL1和SORL1。本研究通過結合前期GWAS結果和肌肉轉錄本表達數據進行綜合分析鑒別到7個與紅細胞性狀相關的基因，其中TMED9、PCK1、TINAGL1和SORL1是GWAS和eQTL共有的候選基因。

關鍵詞：豬；血液性狀；肌肉；表達數量性狀位點；全基因組關聯分析；候選基因

血細胞指血液中的細胞，主要包括紅細胞、白細胞和血小板。在正常生理情況下，血細胞數量及形態維持相對穩定[1]。它的異常改變可以反映機體的異常變化，因此以檢測血細胞形狀和數量的血常規檢測是臨床診斷的常用手段。紅細胞主要功能是運輸氧，數量偏高或偏低，對于身體健康都會產生不利的影響。如果血紅蛋白正常，紅細胞平均體積低，一般是地中海貧血基因攜帶的表現，常出現頭暈、氣短、心悸等典型癥狀。如果血紅蛋白和血細胞數都很高，可能是真性紅細胞增多癥，造成脾肥大及脾梗死。白細胞是身體的免疫衛士，它的數量異常是感染性和炎癥性疾病的重要指標。如細菌、病毒感染可致白細胞數量偏低，嚴重創傷、白血病可致白細胞數量偏高。血小板在止血過程起重要作用，其數量的減少可能是由于特發性血小板減少性紫癜(ITP)導致，該疾病會引起機體胃腸道出血[2]。

臨床常見血液病有白血病、再生障礙性貧血、血小板減少癥、淋巴瘤等，引起血液疾病的因素十分復雜，包括物理、化學、遺傳等因素。鑒于血液病是全球高發疾病之一，大規模基因組關聯分析(GWAS)已經揭示血細胞性狀的遺傳機理非常復雜。P.Van der Harst等[3]對135 367個人的紅血細胞進行GWAS分析鑒別，得到75個數量性狀位點(QTL)，這些位點共解釋了4%～9%的表型變異。本實驗室利用白色杜洛克×二花臉豬F2資源家系通過對豬60K芯片與F2個體的血細胞性狀開展GWAS分析鑒別，得到18個性狀的185個基因組水平SNPs[4]。F.Zhang等[5]在血緣相近的蘇太群體開展GWAS分析鑒別到44個基因組顯著水平的SNPs。由于血細胞性狀的復雜性，在GWAS分析后的因果基因鑒別就顯得異常艱難。

為了彌補GWAS分析只鑒別基因組內SNPs與表型的關系，整合系統生物學通過增加與參與性狀功能的關鍵組織的表達譜分析，通過整合SNPs、表達譜和表型的數據確定表達數量性狀位點(eQTL)，這為鑒別因果基因提供了功能學信息。E.E.Schadt等[6]通過GWAS和eQTL的整合分析鑒別到SORT1和CELSR2為與冠心病和血漿低密度脂蛋白膽固醇水平相關的候選易感基因。C.Y.Chen等[7]綜合分析GWAS、eQTL及性狀相關基因表達成功獲得一個影響低密度脂蛋白膽固醇水平的候選基因。本研究以實驗室前期構建的白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體為研究對象，綜合分析GWAS和肌肉eQTL，鑒別影響家豬血細胞性狀的候選基因以揭示其遺傳機制，為人類血液病的研究提供重要的參考。

1材料與方法

本研究中DNA、RNA提取與血液采集均在省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室進行。

1.1試驗動物和樣品采集

本研究中的試驗群體為實驗室前期構建的白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體。該群體包含1 912個個體，是由2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母豬交配產生的三代群體。試驗動物飼養于標準豬舍內，統一飼喂。試驗動物在(240 ± 3)日齡屠宰，屠宰前禁食12 h。試驗動物屠宰時采集血液注入EDTA抗凝管中，均勻混合，于24 h內送至江西南昌大學第一附屬醫院。試驗動物屠宰后30 min內收集肌肉樣品置于液氮，然后保存于-80 ℃超低溫冰箱內。采集豬耳組織提取DNA。所有樣品的采集符合農業部關于試驗動物的保護條例和使用指南。

1.2血常規檢測

使用CD1700全血分析儀(Abbott，USA)檢測了1 149個個體的紅細胞、白細胞和血小板3大類共18個血常規性狀，其中紅細胞包括：紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細胞體積(MCV)、紅血球計數(RBC)和紅細胞體積分布寬度(RDW)7項指標；白細胞包括：粒細胞計數(GRAN)、粒細胞的數量百分數(GRAR)、單核細胞計數(MON)、單核細胞數的百分比(MONR)、淋巴細胞計數(LYM)、淋巴細胞計數百分比(LYMA)和白血細胞計數(WBC)7項指標；血小板包括：血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW)、血小板數(PLT)及平均血小板體積(MPV)4項指標。

1.3DNA提取及豬60K SNP芯片

豬耳組織樣品用酚/氯仿法提取基因組DNA。經過質量檢測，1 020頭F2個體的DNA樣品統一稀釋至20 ng·μL-1，按Illumina 芯片標準流程用iScan掃描儀(Illumina，USA)進行60K SNP芯片分型。對SNP進行質控，檢測率<95%、次等位基因頻率<5%、哈代-溫伯格檢驗(HWE)P<5×10-6、性染色體連鎖的SNP被篩除。白色杜洛克×二花臉豬F2資源群體有39 454個SNPs通過了質量控制。

1.4RNA提取及轉錄組測序

按照說明書使用TRIzol (Invitrogen，USA)試劑提取了593頭F2個體的肌肉總RNA。使用2100 Bioanalyzer (Agilent，UK)和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。使用oligo-dT磁珠(Invitrogen，USA)將mRNA從總RNA中分離出來，磁珠上的oligo-dT與mRNA的polyA雜交后作為模板用oligo-dT引物合成雙鏈cDNA。使用限制性酶NlaⅢ和MmeⅠ(New England Biolabs，UK)消化雙鏈cDNA，將cDNA片段兩端連接到Illumina特定的接頭，高保真聚合酶擴增構建測序文庫后使用GA Ⅱ測序儀(Illumina，USA)測序。

1.5統計分析

每個轉錄本表達水平的中值用log2計量。在少于20%的個體中表達的轉錄本被濾去，其余轉錄本進行后續分析。表型數據及基因表達數據使用穩健線性回歸模型進行性別、批次和親緣關系的調整。基因表達水平與表型數據的關聯使用R程序包中斯皮爾曼系數進行評估，設定保守閾值P<5×10-4時調整多重檢驗。利用基于R程序包中GenABEL內mmscore的混合線性模型繪制性狀相關的eQTL圖譜，其中性別和批次作為固定效應，由全基因組SNP基因型信息推算的樣本間親緣關系矩陣作為遺傳協方差。采用bonferroni校正多重檢驗效應。基因富集分析使用在線工具DAVID。本研究將QTT與轉錄起始位點5.0 Mb區間內存在的eQTL定義為順式eQTL，否則歸類為反式eQTL。

2結果

2.1表型測定結果

白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體240日齡的18種血常規表型測定結果如表1，測量值由“平均值±標準差”表示。測量個體數不同是由整個群體分若干批次屠宰及數據經過正態分布篩選導致。2.2全基因組關聯分析結果

白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體的240日齡血常規性狀全基因組關聯分析結果見表2。影響240日齡血常規的基因組顯著水平最強相關SNPs集中在7、8號染色體，且HCT和HGB擁有相同的最強相關SNPs，MCH、MCV和RBC也共享最強相關SNP。

2.3數量性狀轉錄本eQTL定位

本研究進行了593頭F2個體肌肉轉錄組測序，檢測全基因組轉錄本的表達水平。所有轉錄本進行質控后共獲得23 727個肌肉轉錄本進入下一步分析。使用斯皮爾曼系數評估肌肉轉錄本表達水平與表型數據的關聯性，當閾值P<5×10-4時，鑒別到78個轉錄本即數量性狀轉錄本(QTT)的表達水平與血紅蛋白(HGB)、紅細胞數目(RBC)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)和白細胞數目(WBC)有關聯。用這78個肌肉轉錄本與39 454個豬60K芯片SNPs進行eQTL映射，當閾值P<10-5時，78個肌肉轉錄本映射到122個eQTLs，每個轉錄本映射到1～9個eQTL，未檢測到所有轉錄本共有的eQTL。為了鑒別上述eQTL與QTT的關系，通過eQTL的SNP與QTT轉錄起始位點在豬物理圖譜上位置進行比對確定兩者間的距離并將兩者各自位置相對照的關系進行分析，結果見表3和圖1。圖1中對角線的點表示順式eQTL的位置，其余點表示反式eQTL的位置。122個eQTLs中有9個順式eQTLs，63個反式eQTLs和50個未知作用的eQTLs。未知作用eQTL的轉錄本或SNP在豬參考基因組上不能準確地被映射到。7號染色體上存有數量最多的eQTL，MCH和MCV的順式eQTL也位于7號染色體且有重疊，因此本研究確定7號染色體SERPINB6是位置候選基因。2.4GO & KEGG富集分析

將上述定位到eQTL的對應基因進行GO & KEGG富集分析(Gene Ontology & KEGG pathway enrichment anakysis)。紅細胞類eQTL對應基因的GO & KEGG富集分析結果見圖2。縱坐標表示性狀相關的轉錄本GO分析后形成的分類，數據標簽表示每個分類對應的基因。其中，紅細胞類eQTL參與了糖異生過程、DNA及丙酮酸的代謝調節、單糖生成、乙醇生成、碳水化合物生成和T細胞受體、細胞粘附分子的信號通路。紅細胞性狀鑒別到的eQTL所參與的信號通路與紅細胞的功能關系密切。通過GO & KEGG富集分析，本研究確定PTPRC和ITGA8為候選基因。

表1白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體240日齡18種血常規表型測定結果Table 1Descriptive statistics of 18 hematological traits at day 240 in the White Duroc × Erhualian pigs F2resource population

白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體的3個日齡段18種血常規表型測定結果詳情見參考文獻[4]Descriptive statistics of 18 hematological traits at 3 growth stages in the F2pigs resource population have been shown in reference[4]

表2白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體240日齡血常規性狀全基因組關聯分析部分結果

Table 2Genome-wide significant loci associated with hematological traits at day 240 in the White Duroc × Erhualian pigs F2resource population by the single-marker analysis

只列出達到基因組顯著水平的最強相關SNPs。白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體的3個日齡段血常規性狀全基因組關聯分析結果詳情見參考文獻[4]

The lead SNPs at the significant level were only listed.Genome-wide significant loci associated with hematological traits by the single-marker analysis has been shown in reference [4] in the F2pigs resource population

表3白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體240日齡血常規性狀相關eQTL結果Table 3Results of eQTL associated with hematological traits at day 240 in the White Duroc × Erhualian pigs F2resource population

2.5eQTL和GWAS的整合分析

綜合分析白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體血常規性狀GWAS和eQTL數據來鑒定影響血液性狀候選基因。結果發現，在GWAS最高SNP位置的5.0 Mb區域內有4個紅細胞性狀相關的反式調控eQTLs，對應的轉錄本分別為gnl|UG|Ssc# PTG01_0098_D10、gnl|UG|Ssc# LVR01_0039_D11、gnl|UG|Ssc# S18548948和gnl|UG|Ssc# S26395831。通過基因注釋查找出gnl|UG|Ssc# PTG01_0098_D10為SSC2上TMED9基因，gnl|UG|Ssc# LVR01_0039_D11為SSC17上PCK1 基因，gnl|UG|Ssc# S18548948為SSC6上TINAGL1基因，gnl|UG|Ssc# S26395831為SSC9上SORL1基因。紅細胞性狀相關eQTL和GWAS整合分析的結果見圖3和圖4。通過eQTL和GWAS整合分析確定該4個基因為本研究獲得的新的影響紅細胞性狀的候選基因。

3討論

GWAS為人類復雜性疾病的分子遺傳機制提供了很多線索，但也有很大的局限性。GWAS依賴統計方法分析遺傳因素與復雜性疾病的關系，可能會出現假陽性和假陰性結果，鑒別到的SNPs只是與疾病相關的SNPs，許多SNPs為常見變異且位于內含子區域或者基因間，這會影響GWAS可靠性和精確性。GWAS難以檢測到罕見SNPs導致只有一小部分SNPs可以解釋其遺傳變異。由于各個群體具有不同的等位基因頻率和連鎖不平衡區域，因此GWAS即使檢測到很多SNPs但鮮有相同位點被檢測到，W.Z.Luo等[8]和J.Y.Wang等[9]兩項研究只有1個位點相同。GWAS需要通過試驗設計、分析方法的改進、大群體反復驗證和大量功能試驗的驗證來鑒別復雜性疾病的致病基因。

目前，許多科學家通過GWAS、eQTL和生物網絡的綜合分析手段已成功鑒定出復雜性疾病相關的基因位點和信號通路。Y.H.Hsu等[10]結合全基因組關聯分析和基因表達譜分析得到RAP1A、TBC1D8、OSBPL1A為骨質疏松癥相關基因。H.Zhong等[11]利用基因表達的遺傳信息和可公開獲得的GWAS結果發現了Ⅱ型糖尿病相關的新的信號途徑。J.Ma等[12]在豬骨骼肌中找到了導致高糖原含量和低肉質的基因—PHKG1，極大地促進了含杜洛克血統豬種的肉質遺傳改良。綜合分析的方法為解析復雜性疾病的發病機制開辟了另一條道路。

肌肉是人和動物機體中代謝十分活躍的組織，通過乳酸循環與血液、肝、腎及其他器官形成了密切的聯系。在紅細胞內乳酸的運輸途徑多達3條[13]。鑒于血液和肌肉之間的內在聯系，我們進行了肌肉轉錄組測序，并且將血液表型相關的轉錄本與豬60K芯片SNPs進行eQTL定位。由于我們僅將與血液表型相關的轉錄本進行eQTL分析，因此得到的反式調控eQTL多于順式調控eQTL。從圖1可以看到MCH和MCV的順式eQTL位于7號染色體且位置重疊。7號染色體上存在數量最多的eQTL，與GWAS在此染色體定位到大量SNPs相一致，但大量反式eQTL的存在也提示血液性狀受到更多微效基因的控制。通過豬60K芯片SNPs進行eQTL映射后，確定7號染色體上的SER-PINB6是位置候選基因。SERPINB6編碼的蛋白

已被確定為胎盤凝血酶抑制劑[14]，是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，絲氨酸蛋白酶抑制劑是結構相關蛋白質，調節絲氨酸蛋白酶的活性，絲氨酸蛋白酶參與凝血、纖維蛋白溶解、炎癥、細胞凋亡和腫瘤發生等過程[15-17]，因此SERPINB6可以抑制凝血酶等胰蛋白酶樣蛋白酶。

本研究通過GO & KEGG 富集分析確定PTPRC和ITGA8為影響血液性狀的候選基因，這2個基因與血細胞數量和形態有關。PTPRC在除紅細胞和血小板外的所有造血細胞內特異表達，它是白細胞共同抗原[18-19]，參與調節造血細胞生長、分化和活化[20-21]。PTPRC與淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病和急性非淋巴細胞白血病的發生有著密切的關系。ITGA8的突變會造成雙側腎發育不全[22]。人和動物出生后腎取代肝成為紅細胞生成素(EPO)主要合成場所，而EPO是紅細胞生成的主要調節劑，因此ITGA8與紅細胞的生成存在一定的聯系。

本研究結合實驗室前期的GWAS研究成果及eQTL進行綜合分析，獲得4個新的影響紅細胞的候選基因TMED9、PCK1、TINAGL1和SORL1。TMED9是位于內質網和高爾基體編碼轉運蛋白的基因，目前鮮有關于TMED9功能的報道，但TMED9可以與IKBKE、TRAF6形成基因網絡，IKBKE參與許多信號途徑，包括toll樣受體信號和信號轉導，誘導細胞凋亡[23]。PCK1編碼PEPCK-C，它是肝和腎中一個關鍵的糖異生酶[24]。在PCK1調控區域內含有脂肪特異性啟動子PCK2，PCK2的C、T等位基因對肥胖型Ⅱ型糖尿病患者的糖化血紅蛋白A1c水平有共顯性效應[25-26]。TINAGL1也被稱為腎上腺皮質成帶因子1，其編碼的蛋白質與腎小管間質性腎炎抗原序列相似，該基因與腎上腺皮質細胞的成帶分化緊密相關[27]。作為I型跨膜蛋白，SORL1包含不同的結構域，同時屬于低密度脂蛋白受體家族和液泡蛋白分選10結構域受體家族。SORL1在淀粉樣前體蛋白的轉運和加工方面起關鍵監管作用[28]，同時參與β淀粉樣蛋白的破壞[29]，與ApoE基因互作[30]，對阿爾茨海默氏病具有積極的作用[31]。這4個基因均尚未有與血液性狀相關的報道，因而需要進一步研究。

4結論

本研究測定了白色杜洛克×二花臉豬資源家系F2群體1 149個個體的18種血常規性狀，進行了1 020頭F2個體的60K SNP芯片分型和593頭F2個體的肌肉轉錄組測序，使用回歸模型分析與血細胞性狀關聯的轉錄本，得到78個與血細胞強相關的轉錄本。用血細胞性狀強關聯的轉錄本進行eQTL定位，得到122個eQTLs，其中有9個順式eQTLs和63個反式eQTLs。通過eQTL定位、GWAS和eQTL的綜合分析鑒別到與紅細胞性狀相關的基因中TMED9、PCK1 、TINAGL1和SORL1是GWAS和eQTL共有的候選基因。

致謝：江西農業大學黃路生教授在試驗材料和研究思路設計方面提供了重要指導，在此表示衷心感謝！感謝江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室的全體老師和學生在群體屠宰、樣品采集和統計分析過程中提供的幫助。

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(編輯郭云雁)

A Systems Genetics Study of Hematological Traits in a White Duroc × Erhualian Pigs F2Resource Population

XU Pan，ZHANG Zhen，CUI Lei-lei，YANG Bin，DUAN Yan-yu*

(StateKeyLaboratoryforPigGeneticImprovementandProductionTechnology，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

Key words:pig；hematological traits；muscle；expression quantitative trait loci；genome-wide association study；candidate gene

Abstract:To dissect the hereditary basis for hematological traits，we integrated the results of genome-wide association study and muscle expression quantitative loci(eQTL) analysis to identify the candidate genes in a White Duroc×Erhualian pigs F2resource population on the basis of systems genetics.In this study，the 18 hematological parameters of 1 149 pigs were measured and the expressed transcripts of muscles in 593 pigs were detected，1 020 individuals were genotyped.The correlations between gene expressions and phenotypic data were evaluated using Spearman correlation coefficient.Those eQTL were identified by aligning the related transcripts with the pig reference genome and their ontology enrichment were also implemented.We also performed the integrated analysis by incorporating eQTL information into our blood-based GWAS data.In this study，122 eQTLs were identified including 9 cis-eQTLs and 63 trans-eQTLs with a conservative thresholdP<5×10-4.Of them，SERPINB6 was an identified candidate gene by eQTL.PTPRCandITGA8 were prioritized as candidate genes by gene ontology enrichment analysis.TMED9，PCK1，TINAGL1 andSORL1 were highlighted as the most promising candidate genes by integrative eQTL and GWAS analysis.We identified 7 novel candidate genes by integrating the previous blood-based genome-wide association study and muscle gene expression profiles analysis.PCK1，TMED9，TINAGL1 andSORL1 shared the association signals of GWAS and eQTL.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.004

收稿日期：2015-02-16

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102502)；江西省科技廳科技支撐項目(2009BNA06900)

作者簡介：徐盼(1988-)，男，江蘇南京人，博士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：panxu_nj@hotmail.com *通信作者：段艷宇，博士，講師，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：yanyuduan@hotmail.com

中圖分類號：S828；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0232-09