利用SNP標記估計西門塔爾牛親緣關系系數的準確性

張靜靜，高會江，吳　洋，朱　波，齊　欣，高　雪，張路培，陳　燕*

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

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利用SNP標記估計西門塔爾牛親緣關系系數的準確性

張靜靜1，2，高會江2，吳洋2，朱波2，齊欣2，高雪2，張路培2，陳燕2*

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

摘要：本研究旨在利用SNP標記估計西門塔爾牛親緣關系系數，以期準確確定估計個體間親緣關系系數所需的SNPs數量。研究以1 059頭出生于2008-2012年的西門塔爾牛為試驗群體，利用Illumina bovineHD(770 k)芯片，根據最小等位基因頻率(MAF)區間，分別選擇100、500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 個SNPs用于個體間親緣關系系數的估計。結果顯示，隨著標記數目的增多，估計的親緣關系系數準確性逐漸增加。且當SNP標記數目達到2 500時，所估計的親緣關系系數與利用所有標記估計的個體間親緣關系系數差異不顯著，二者相關系數達到0.89 以上。同時，利用不同等位基因頻率區間內標記估計的個體間親緣關系系數差異不顯著。由此可以看出，當所選標記數目達到2 500以上時，可以得到較高的親緣關系系數估計準確性。本研究為基于SNP標記信息估計親緣關系系數的進一步研究提供了理論基礎，同時為西門塔爾牛群體個體間親緣關系的研究提供依據。

關鍵詞：西門塔爾牛；親緣關系系數；SNP；最小等位基因頻率

肉牛遺傳評估工作的核心內容就是育種值估計。而在眾多的育種值估計的方法中，最佳線性無偏預測(Best Linear Unbiased Prediction，BLUP)仍是最為有效和使用最為廣泛的方法。其通過構建個體間的遺傳關系矩陣來完成個體育種值的估計。BLUP方法的優勢在于能夠充分利用個體之間的相關信息，即通過系譜信息構建的加性遺傳關系矩陣(A matrix)來反映個體間的遺傳相關關系并估計育種值。然而在實際生產過程中，因為往往存在著系譜錯誤、缺失和近交等問題，A陣可能有較低的準確性[1]。而且這種只通過系譜資料所獲得的遺傳相關關系只是親緣關系的期望值，而真實的遺傳相關關系會由于孟德爾抽樣誤差而與期望值有所偏差[2]。

近年來，育種技術的不斷發展使我國肉牛業取得了長足的進步。但是與發達國家相比，我國肉牛產業仍然處于初級階段。公牛遺傳評估技術的落后更是制約我國肉牛業發展的一個重要問題。錯誤的系譜信息將在很大程度上降低公牛遺傳評估的準確性，進而降低群體的遺傳進展。為降低系譜錯誤對育種帶來的不利影響，提高育種值估計的準確性，進而加快我國肉牛的遺傳進展，建立完整、準確的系譜信息顯得尤為重要。而準確系譜信息的建立除嚴格的生產管理制度外，更有賴于個體間親緣關系的估計。

在過去的十年里，對利用分子標記估計親緣關系進行了很廣泛的研究，出現了很多新方法以及軟件[3-5]。多項研究表明，分子標記如微衛星和SNP是檢驗和鑒定親子關系的有效工具[6]。 SNP標記信息也被用于估計群體中個體之間的親緣關系[7-8]。此外，研究還表明，有限的SNPs標記數目是限制親緣關系估計準確性的主要瓶頸[9]。隨著高通量測序和高密度基因分型芯片的快速發展，數以千計的SNPs信息都能快速獲得，進一步提高了分子標記在估計親緣關系上的適用性。P.M.Vanraden首次提出了基于高密度SNP芯片獲得的SNPs信息估計親緣關系矩陣(Genomic Relationship Matrix，通常稱為G陣)，它可以代替A陣進行基因組育種值的估計[10]。結果表明，系譜缺陷和孟德爾抽樣誤差等因素導致了A陣估計不準確，而利用高通量的SNP標記估計的G陣更接近于真實的個體間遺傳相關關系[11-12]。

另一方面，新的高通量基因分型技術的快速發展和高密度SNP芯片的出現產生了海量數據，也帶來了高額的檢測費用以及復雜的計算方法。為降低基因分型檢測成本、節約計算時間，從高密度SNP標記中篩選高信息度的標記，用于估計個體親緣關系受到眾多研究者和育種家的關注。在豬的研究中，M.S.Lopes等研究表明需要至少有2 000 個SNPs標記用來估計遺傳關系矩陣[13]。在牛的研究中，M.M.Rolf等研究發現利用2 500～10 000個標記時就能獲得較高的親緣關系估計準確性[14]。

本研究以西門塔爾牛為研究群體，使用Illumina bovineHD(770 k)牛高密度SNP芯片，依據不同的標記密度和最小等位基因頻率(MAF)，分別選擇100、500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000個標記，估計個體間親緣關系系數，并比較其準確性，以期優化標記選擇方法和確定準確估計親緣關系系數所需SNPs的數量。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究的試驗群體來自中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牛遺傳育種研究室在內蒙古烏拉蓋地區構建的西門塔爾牛資源群體。試驗動物選自出生于2008～2012年的1 087頭西門塔爾公牛，詳細情況見表1。

表1西門塔爾牛出生年分布

Table 1Birth year distribution for the genotyped Simmental cattle

1.2基因型數據處理

試驗群體使用了Illumina bovineHD(770 k)芯片進行全基因組基因型測定，該芯片包含777 962個SNPs位點。在分析之前，所有SNP均進行質量控制，去除SNP檢出率<95%、最小等位基因頻率(Minor allele frequency，MAF)<1%、極端不符合哈代-溫伯格平衡檢驗P<10-6以及沒有染色體位置信息的SNP位點和個體檢出率<90%的個體。質量控制主要是利用PLINK軟件[15]完成。運行命令如下：plink-cow—file filename—maf0.01—geno0.01—mind0.1—hwe0.000001-recode12-out filename。

1.3SNP的不同篩選方法

本研究中采用在3種不同MAF區間(0.01～0.2，0.2～0.4和0.4～0.5)中等距離篩選多個標記密度形成分析數據集。標記數目方面分為7個密度梯度等級，分別為100、500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000個。然后，將不同MAF區域篩選的不同密度梯度的標記信息用于估計個體之間親緣關系系數及它們的準確性，每組重復100次，并進行t檢驗評價準確性之間是否存在差異。以上工作，均是利用R語言自編程序計算完成。

1.4連鎖不平衡程度(LD)的計算

連鎖不平衡程度(LD)的計算已有多種不同的方法，每一個都有不同的統計效用，其中以D′[16]和r2[17]最為常用。但是r2對基因頻率和有效群體大小的變化不敏感[18]，被廣泛認為更加穩健并且是描述LD水平更好的參數。本研究采用r2作為LD的衡量指標[19]。

假定有兩個位點，A和B，每個位點分別有兩個等位基因，A1，A2和B1，B2。其等位基因頻率分別用PA1，PA2，PB1，PB2表示。用P11，P12，P21和P22指代單倍型A1B1，A1B2，A2B1和A2B2的頻率。計算這種連鎖不平衡的方法：

本研究運用PLINK[15]軟件(http：//pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/)計算各子集中SNP之間的r2。

1.5親緣關系系數的計算

把上下代個體間和同世代個體間的親緣關系稱為親緣相關或血緣相關，有時也稱為個體間的遺傳相關。本研究使用J.Yang 等[20]提出的利用個體間基因組親緣關系系數的算法計算親緣關系系數，公式：

其中，i為第i個SNP位點，j為第j個個體，k為第k個個體，N為SNP位點總數，Pi為第i個位點等位基因頻率。Xij對應aa、Aa、AA基因型取0、1、2。

本研究使用 770 k SNP計算的親緣系數和篩選SNP計算的親緣系數的相關系數來表示準確性，公式：

其中，r為準確性，Kin1為使用所有標記計算的親緣系數，Kin2為使用抽取的標記計算的親緣系數。

2結果

2.1數據質控

數據詳細的質控情況見表2。經過質控后共得到682 259 個SNPs位點和1 059個體用于下一步的分析。質量控制前后SNP位點在各染色體上的分布情況如圖1所示，從圖中可以看出不合格SNP位點數在各條染色體上所占比例相當。圖2表示的是用于本研究群體中SNPs最小等位基因頻率分布，從圖中可以看出，全部SNPs的MAF分布均勻。此群體的平均MAF為0.24。

表2SNPs質量控制統計

Table 2SNPs quality control statistic

2.2親緣關系系數分析

本研究在3個MAF區間(0.4～0.5，0.2～0.4和0.01～0.2)，分別選取100、500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000個標記，總計獲得了21個SNP子集的數據。圖3展示了在3個MAF區間內的標記數目分布。統計了選取的每一個SNP子集中相鄰SNP間的連鎖不平衡程度r2值(表3)。隨著標記數目增多，SNP之間的連鎖程度加大。其中，在選取3 000個來自于MAF區間(0.01～0.2)的SNP有最大的r2值，連鎖程度最高。在研究中將所篩選的不同密度梯度的標記信息用于估計個體之間的親緣關系系數，并和使用所有標記獲得的親緣系數計算相關性。

對質控后的1 059頭西門塔爾公牛使用所有682 259個 SNPs估計個體間的親緣系數，得到群體的親緣系數平均值為0.09，標準差為0.07。此外，對21個SNPs子集進行了親緣系數估計，所得結果顯示，當所選標記數目為N=3 000時，通過3種MAF區間(0.4～0.5，0.2～0.4和0.01～0.2)篩選標記計算的西門塔爾公牛個體間親緣關系系數與所有SNP數據計算的親緣系數有最高的相關性，分別為0.94±0.001(P=0.792)、0.94±0.001(P=0.339)和0.90±0.004(P=0.693)，親緣系數分別為0.08、0.08和0.06。

表3相鄰標記間的連鎖不平衡程度統計

Table 3Extent of linkage disequilibrium between 2 adjacent SNPs

表中所列數值為r2的平均值±標準誤

Values listed in the table as the mean ± standard error ofr2

圖4列出了3種MAF區間(0.4～0.5，0.2～0.4和0.01～0.2)下，不同SNP標記數目所得親緣系數與所有SNP數據計算的親緣系數相關性的盒圖。從圖中可以看出，當所選標記為100時，3種篩選方法所得準確性均表現最低，分別為0.45±0.007(P=0.834)，0.44±0.007(P=0.963)和0.43±0.023(P=0.680)。當標記數目從100逐漸增加至1 500時，親緣系數的相關性隨著標記數目增加顯著增加，之后增加的趨勢減緩。且可以看出在標記數目為100時，親緣系數的相關性有較大的波動。但是，選自0.4～0.5和0.2～0.4 MAF區間的標記，隨著其數目增加，從圖中可以看出親緣系數的相關性非常穩定，而來自0.01～0.2區間標記，其相關性還是有明顯的波動。

圖5表示的是不同標記數目下，不同MAF區間所得親緣系數的準確性。從圖中可以得到，SNP選自MAF 0.4～0.5和0.2～0.4，親緣關系相關系數增長趨勢一致，且基本吻合。SNP選自MAF 0.01～0.2，親緣系數準確性也是保持增長趨勢，但是增長速度相對較低。

綜上所述，我們可知選擇最小等位基因頻率大于0.2且不連鎖的SNP，在數目達到2 500個時親緣系數的估計值有高的準確性(相關系數大于0.89)。

3討論

隨著高通量測序和基因分型技術的出現，利用SNP標記構建基因組親緣關系矩陣(G陣)來替代傳統的加性遺傳矩陣已經展開了大量的研究[10，12，21-22]。本研究在不同最小等位基因頻率區間內隨機抽取7個標記密度(N=100、500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000)的SNPs，用于群體內個體間親緣系數的計算。研究結果表明，標記位點的最小等位基因頻率對個體間親緣關系系數的計算有一定的影響，且在標記數目達到2 500時估計的親緣系數有高的準確性。

3.1SNP的篩選

本研究中，將標記位點的最小等位基因分為3個區間，區間內位點隨機抽取，并沒有考慮位點之間是否關聯。但是，當標記密度足夠大的時候標記之間存在連鎖不平衡狀態，它們并不能完全獨立分離的傳遞給下一代。在遺傳信息傳遞過程中，每個子代總是精確的遺傳來自雙親常染色體遺傳物質的一半。但對位于X染色體上的遺傳信息而言，它的傳遞往往與性別有關，這就使得在計算親緣關系系數時，位于X染色體上的SNP標記信息將能更有效的估計出雌性個體間的親緣相關關系，對雄性間的親緣關系系數估計能力較差。而同性別后代的孟德爾抽樣誤差要比父本低[23]。此次研究群體以雄性個體為主，為此，該研究過程中，選擇了剔除X染色體上的標記位點。

最小等位基因頻率和標記密度是影響親緣相關系數準確性的重要因素。C.Y.Chen等報道了在荷斯坦牛群體中使用相等的等位基因組頻率能夠獲得非常準確的親緣相關系數和較小的偏差[24]。S.Ogawa等在日本黑牛群體中研究發現，隨著標記數目增加親緣相關系數估計準確性增加，當標記數目達到10 000時達到穩定[25]。因此，本研究在3個MAF區間(0.4～0.5，0.2～0.4和0.01～0.2)，分別隨機選擇7組SNP(數目分別為100、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000)形成子集，來估計親緣系數。

3.2親緣關系系數的估計

本研究選擇了西門塔爾牛資源群體，通過選擇3個MAF區間的SNP標記來分析最小等位基因頻率對親緣關系系數估計的影響。結果表明，使用來自MAF 0.2～0.4和0.4～0.5兩個區間的SNP估計的群體的親緣系數的平均值和標準差是相近的，高于使用MAF 0.01～0.2區間內的SNP。根據前人研究報道，增加標記的數據量可能不會明顯增高親緣相關系數估計的準確性，且群體親緣系數矩陣(G陣)的估計最好使用完全不連鎖的標記[14]。另一項研究[26]認為，隨著標記密度增加，標記的連鎖程度加大，導致了大量的標記信息的浪費。本研究使用了7個梯度的SNPs數目來估計親緣系數，準確性是用和所有標記估計的親緣系數相關性來表示，結果也驗證了降低標記數目，沒有導致親緣系數準確性的顯著下降。因此，使用低密度的SNP標記能夠準確估計群體間親緣相關系數，這就使降低基因分型成本成為了可能。

對于群體親緣系數的估計，使用的SNP標記來自于MAF 0.2～0.4和0.4～0.5，這兩個區間估計準確性非常相近，且都是顯著高于來自于MAF 0.01～0.2區間SNP估計的親緣系數。這個可能是很多低頻的SNP由于基因分型技術導致基因型錯誤，進而影響了親緣系數估計準確性。因此在估計群體中個體間的親緣系數時，應選擇高頻的SNP標記(MAF>0.2)。研究中還統計了每個子集中相鄰SNP間的連鎖程度(表3)，r2值都是小于0.1的。隨著標記數目的增多，連鎖程度增加，親緣系數估計的準確性也增加，這個研究結果是和前人報道相一致的[25]。

當前研究已經顯示，在西門塔爾牛群體中利用大于等于2 500個不連鎖且最小等位基因頻率大于0.2的SNP標記就能獲得準確的親緣相關系數。這個研究結果是和M.M.Rolf等在安格斯牛群體估計SNP數目在2 500～10 000個時能夠獲得一個穩健的親緣相關系數[14]相一致。M.S.Lopes等在豬中發現，獲得一個高精度的親緣相關系數，至少需要2 000個SNPs[13]。在豬群體中可以用比較少的SNPs來構建G陣，這可能是因為它們基因組大小和單倍型塊長度的差異引起的：J.A.Arias等觀測到牛的基因組遺傳長度是3 249 cM[27]；而豬的基因組遺傳長度則在1 797和2 149 cM之間[28]。此外，R.Veroneze等發現，豬群體中平均的單倍型塊大小是395 kb，遠大于荷斯坦奶牛的平均單倍型塊大小(164 kb)[29-30]。

4結論

高密度的SNP芯片已經在動物育種中廣泛應用。但是這種芯片的價格較貴，并需要花費成倍時間運算。因此利用少量SNP標記進行基因組選擇成為研究熱點。本研究探討了標記最小等位基因頻率和密度對估計親緣系數準確性的影響，結果表明，選擇最小等位基因頻率大于0.2且不連鎖的SNP，在數目達到2 500個時親緣系數的估計值有高的準確性。

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(編輯郭云雁)

Estimation of the Kinship Coefficient in Simmental Cattle Based on SNP Markers

ZHANG Jing-jing1，2，GAO Hui-jiang2，WU Yang2，ZHU Bo2，QI Xin2，GAO Xue2，ZHANG Lu-pei2，CHEN Yan2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

Key words:Simmental cattle；kinship coefficient；SNP；MAF

Abstract:The objective of the study was to determine the number of SNPs which could efficiently estimate the kinship coefficient in Simmental cattle.1 059 Simmental cattle born between 2008 and 2012 year were used as the reference population.Based on the interval of the minor allele frequency (MAF)，100，500，1 000，1 500，2 000，2 500 and 3 000 SNPs located in Illumina bovineHD(770 k)chip were selected to estimate individual kinship coefficient.The results showed that with the increase of the SNPs’ number，the estimation accuracy showed an increasing trend as well.Especially，when the SNPs’ number reached to 2 500，there was no significant difference between relationship coefficients estimated using 2 500 SNPs and all SNPs，and the relationship coefficients were above 0.89 between them.Furthermore，the SNPs in the same interval with different allele frequency had no significant impact on the results.It was concluded that when the number of selected SNPs reached more than 2 500，a relatively higher estimation accuracy could be obtained.Our work has built a theoretical basis for further study of the kinship coefficient with high density SNP and provides a new clue for analyzing individual kinship relationship in Simmental cattle.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.008

收稿日期：2015-03-30

基金項目：國家自然科學基金(31402039)；北京市自然科學基金(6154032)；中國農業科學院基本科研業務費(2014ywf-yb-4)；農業部物種資源保護(畜禽)項目(F557)；中國農業科學院科技創新工程經費(cxgc-ias-03)；科技支撐計劃(2011BAD28B04)；863項目(2013AA102505-4)；中國農業科學院院本級增量業務費(2013ZL031)

作者簡介：張靜靜(1989-)，女，山東莘縣人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：zhang_jingjing89@163.com *通信作者：陳燕，E-mail：chenyan@caas.cn

中圖分類號：S823；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0268-08