lpa-miR-nov-66調控羊駝黑色素細胞CDK5磷酸化作用的研究

張俊珍，姬凱元，石占全，劉　彧，胡帥鵬，范瑞文

(山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

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lpa-miR-nov-66調控羊駝黑色素細胞CDK5磷酸化作用的研究

張俊珍，姬凱元，石占全，劉彧，胡帥鵬，范瑞文*

(山西農業大學動物科技學院，太谷 030801)

摘要：旨在研究lpa-miR-nov-66在調控羊駝黑色素細胞產生黑色素顆粒過程中對細胞周期依賴性激酶5(CDK5)磷酸化作用的影響。在體外培養的黑色素細胞中轉染lpa-miR-nov-66后，采用實時定量PCR、免疫細胞化學、Western blotting、免疫共沉淀等方法檢測功能性CDK5作用。結果顯示：與陰性對照相比，黑色素細胞被轉染lpa-miR-nov-66后，CDK5基因和蛋白表達量均下降，差異極顯著(P<0.01)；CDK5激活子是P35，CDK5磷酸化水平及其磷酸化底物——酪氨酸羥化酶(TH)的表達量均被上調，分別呈差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。結果表明：lpa-miR-nov-66過量表達可通過CDK5的激活子P35上調黑色素細胞CDK5發生磷酸化。該功能性CDK5激酶對底物TH發生磷酸化，是lpa-miR-nov-66調控黑色素生成分子機制的中間環節。

關鍵詞：lpa-miR-nov-66；細胞周期依賴性激酶5(CDK5)；酪氨酸羥化酶(TH)；黑色素細胞

lpa-miR-nov-66是從不同毛色羊駝皮膚的基因表達譜中發現的新的且差異表達的miRNA[1]，其靶基因之一是可溶性鳥氨酸環化酶(Soluble guanylate cyclase，sGC)，lpa-miR-nov-66與sGC的CDS區結合，使sGC在代謝過程中產生cGMP，從而下調黑色素的生成[2]。無論何種物種，sGC的所有信號轉導均通過提高cGMP濃度后，cGMP代謝產物G-激酶可對絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化，再通過cGTP調控的磷酸二酯酶調節cAMP水平而實現，繼而引起細胞內反應[3]。

CDK家族(CDK1～20)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調控細胞周期過程、轉錄過程和神經功能中起關鍵作用[3]。CDK5是細胞周期家族成員之一，但CDK5的作用不同于其他家族成員，對細胞周期不起作用[4]。在前期的研究中發現羊駝皮膚cDNA文庫中有CDK5表達[5]，并且CDK5在不同毛色的羊駝皮膚中的表達呈顯著差異[6]，在體外培養的黑色素細胞中，CDK5定位于胞質和胞核中[7]，這些均提示，CDK5可能與黑色素細胞存在著相關性。在黑色素生成路徑中，cAMP是調控色素形成的關鍵信使[8]，研究發現，lpa-miR-nov-66在羊駝黑色素細胞中，調控黑色素生成的cAMP路徑，引起酪氨酸酶(TYR)及其相關蛋白(TYRP1和TYRP2)的表達下調[2]。CDK5能使體內外的酪氨酸酶(TYR)的羥化酶(TH)發生磷酸化，從而使TYR的活性增強[9]，而TYR是黑色素細胞合成黑色素過程起催化作用的限速酶[10]。在哺乳動物黑色素合成的cAMP路徑中，lpa-miR-nov-66是否可通過磷酸化CDK5而影響黑色素顆粒的生成未見報道，本研究主要通過檢測lpa-miR-nov-66 對CDK5磷酸化作用的影響，為揭示lpa-miR-nov-66調控黑色素生成的分子機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

所用細胞為本實驗室保存的分離培養后傳代的第4代羊駝黑色素細胞。pcDNA6.2-lpa-nov-miR66是由Invitrogen公司構建，用于轉染羊駝黑色素細胞[2]。

1.2方法

1.2.1羊駝黑色素細胞的處理及分組復蘇凍存的羊駝黑色素細胞，待細胞豐度達70%時，棄去細胞中的培養基，加入0.8 mL培養基，將準備好的質粒和轉染試劑混和液(500 μL培養基中含3 μg質粒和6 μL Lipfectamine2000)加入細胞培養基中，混勻，置于培養箱中，37 ℃培養36 h后，用正常培養基終止轉染。收集細胞，用于RNA和蛋白質提取以及免疫細胞化學。試驗組和對照組(Negative control)各設3個生物學重復。

1.2.2細胞總RNA的提取和cDNA合成羊駝黑色素細胞結束轉染后，用PBS沖洗3次，按說明書提取總RNA(Invitrogen)，制備cDNA：反應體系：10 μL反應體系中含2 μL 5×Prime ScriptTMBuffer，10.5 μL Prime ScriptTMRT Enzyme Mix，25 pmol Oligo dT 引物，50 pmol隨機引物，0.5 μg 總RNA，DEPC水加至10 μL，體系混勻，按37 ℃15 min，85 ℃5 s反應產生cDNA。

1.2.3實時熒光定量PCR按SYRB(TaKaRa)構建好反應體系后(目標基因的引物見表1，退火溫度為57 ℃)，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，35個循環進行實時熒光定量PCR。內參基因為18S，每個樣本設3次重復，獲取CT值。用2-△△CT法計算各基因在mRNA水平的相對表達量。

表1定量PCR引物序列

Table 1Quantitative PCR primer sequence

1.2.4免疫細胞化學轉染的細胞用4%多聚甲醛在4 ℃固定20 min，在3%的過氧化氫溶液室溫反應30 min、5%BSA血清封閉30 min、滴加一抗(兔來源CDK5，1∶75，Boster，Wuhan，China；兔來源anti-phophy-CDK5(Tyr15))，4 ℃放置過夜，滴加二抗(HRP山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1.5 h，加入DAB顯色液，顯微鏡觀察并采集圖像(OLYPUS，FV1000)。陰性對照組PBS代替一抗。

1.2.5免疫印跡用總蛋白提取試劑盒(Beyotime Biotechnology)提取轉染的羊駝黑色素細胞中的總蛋白，測定濃度后，進行SDS-PAGE電泳：每孔上樣200 μg總蛋白，在30 V條件下，電泳5 h；將膠上的蛋白質用電轉儀轉移至PVDF膜，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1.5 h，并將轉印膜放入平皿內，加入anti-phophy-CDK5(Tyr15)多克隆抗體(1∶300)和anti-CDK5多克隆抗體(1∶300)，4 ℃搖床過夜孵育后，用TBST洗膜3次。加入二抗(HRP山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1.5 h，加入ECL發光劑，3 min后甩去工作液，曝光。總蛋白中的目的蛋白和β-actin免疫印跡結果用Image-proplus 6.0軟件(Olympus)進行統計和半定量分析印跡條帶面積和灰度值。蛋白總量=條帶面積×灰度值。

1.2.6免疫共沉淀用總蛋白提取試劑盒(Beyotime biotechnology)提取轉染的羊駝黑色素細胞中的總蛋白，測定濃度后，將CDK5一抗(Abcam)加入200 μL 總蛋白中，4 ℃輕搖孵育過夜后，加入20 μL 蛋白G瓊脂磁珠，4 ℃輕搖孵育1 h，獲得免疫沉淀，該沉淀用500 μL 1×細胞裂解緩沖液洗5次后，懸浮于20 μL 3× SDS緩沖液中，95 ℃加熱5 min，14 000 g離心1 min，點樣到SDS-PAGE膠(12%～15%)。anti-P35和anti-TH的免疫印跡方法同1.2.5。

1.2.7統計分析實時定量PCR結果以及免疫印跡和免疫共沉淀條帶經灰度分析后的結果均用“平均值±標準誤(Means±SE)”表示，數據用SPSS16.0軟件進行統計分析。

2結果

2.1對黑色素細胞內CDK5在轉錄水平的表達分析

實時定量PCR結果表明：與陰性對照組相比，轉染lpa-miR-nov-66基因的羊駝黑色素細胞中CDK5基因在轉錄水平下降了0.52倍，試驗組與對照組呈差異極顯著(P<0.01) (圖1)。

2.2對黑色素細胞內CDK5蛋白水平的表達分析

Western blotting結果顯示，羊駝黑色素細胞總蛋白中存在能與兔抗CDK5多克隆抗體發生免疫陽性反應的蛋白條帶，且符合預期大小(圖2A)。對不同試驗組羊駝黑色素細胞目的蛋白表達進行定量分析：應用Image-proplus6.0軟件對目的基因和內參β-actin的免疫印跡進行半定量分析，試驗組與對照組差異極顯著(P<0.01) (圖2B)。

2.3對羊駝黑色素細胞內CDK5磷酸化的影響

免疫細胞化學結果顯示，羊駝黑色素細胞內轉染lpa-miR-nov-66后，與對照組相比，胞漿內可見磷酸化CDK5 的免疫陽性信號。與對照組相比，轉染lpa-miR-nov-66后的羊駝黑色素細胞內磷酸化CDK5免疫強度增強(圖3)。

2.4黑色素細胞內酪氨酸羥化酶和P35的表達

經CDK5富集細胞總蛋白后，將P35和TH做免疫共沉淀，結果發現CDK5磷酸化的激活子是P35，轉染lpa-miR-nov-66后，黑色素細胞內P35的表達水平極顯著升高(P<0.01)(圖4)；而酪氨酸羥化酶(TH)是CDK5的作用底物，且轉染黑色素細胞后TH的表達顯著升高(P<0.05)(圖5)。

3討論

CDK5在神經發育過程中起重要作用[4，11]。有研究認為，CDK5是神經元特異性的激酶[12]。后來，CDK5被發現在人類癌癥發生過程中起重要作用，并陸續發現CDK5在多種細胞中表達，具有調控細胞生長和遷移等新的功能[11]。前期的研究證實CDK5的免疫陽性反應物主要位于羊駝毛球和外根鞘，而且白色羊駝皮膚中CDK5 mRNA 表達豐度低于褐色羊駝皮膚中的表達[6]，證實CDK5與羊駝黑色素細胞中毛色相關基因的表達存在著相關性[5-7]。黑色素細胞是由原始的神經嵴細胞分化形成的，之后進入正在發育的毛囊毛球部[13]，毛球部黑色素細胞產生的黑色素體進入周圍毛干的角化細胞中，毛干中黑色素的數量、大小、組成以及分布的不同而產生不同的毛色[14]。

Lpa-miR-nov-66作為一個新的miRNA，在白色羊駝皮膚中的表達量顯著高于棕色羊駝皮膚表達量，其靶基因為sGC，通過cAMP路徑調控羊駝黑色素生成[2]。sGC的所有信號轉導均通過提高cGMP濃度后，cGMP代謝產物G-激酶對絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化，再通過cGTP調控磷酸二酯酶調節cAMP水平而實現的[3]。本研究中檢測到lpa-miR-nov-66過表達可使黑色素細胞中CDK5在轉錄和翻譯水平的表達量減少，但磷酸化的CDK5表達量增強，結果說明CDK5磷酸化在lpa-miR-nov-66發揮作用過程中起著至關重要的作用。而磷酸化的CDK5和其他家族成員一樣，發揮其功能時需要激活子，本研究發現，CDK5免疫共沉淀中同時檢測到P35和P25。P25是P35被calpain剪切后殘留下來的羧基端(Carboxy-terminal)部分，比P35可以更長時間地激活CDK5。結果說明P35/P25與CDK5結合，CDK5的激活子是P35。

在黑色素生成路徑中，G蛋白偶聯受體(GPCR)介導的跨膜信號轉導合成黑色素是重要的途徑之一。促黑色素細胞激素(α-MSH)與黑色素細胞膜上的褪黑激素受體(MC1R)結合后可激活Gs蛋白，Gs蛋白激活膜內側的腺苷酸環化酶(AC)，AC的活化使細胞內cAMP水平升高[15]。cAMP激活參與色素沉積的一些細胞內信號途徑[16]，活化蛋白激酶A(PKA)導致CREB(cAMP-responsive element-binding)的磷酸化[17]。磷酸化的CREB可激活小眼畸形相關轉錄因子(MITF)，MITF通過調控黑色素生成相關基因的表達而調節黑色素細胞的分化、增殖和存活[18-19]。在毛色形成的分子通路上，MITF是一個重要的轉錄調控因子，它通過調控形成黑色素的重要基因而影響黑色素細胞的發育，如TYR及其相關蛋白1和2(TYRP1和TYRP2)[15]。TYR是黑色素細胞中由酪氨酸生成黑色素過程起催化作用的限速酶[8]，具有酪氨酸羥化酶(TH)和多巴氧化酶2種活性，TH催化生成兒茶酚胺多巴路徑中的關鍵步驟，而兒茶酚胺多巴是真黑素合成的底物[20-21]。本研究結果表明，TH是CDK5的作用底物，且在轉染lpa-miR-nov-66的黑色素細胞中可檢測到TH的表達量發生變化，在前期的研究結果認為lpa-miR-nov-66通過靶基因sGC經cAMP路徑調控黑色素的合成，而cAMP可以與蛋白激酶A(PKA)調節亞基相結合，從而允許釋放和激活催化亞基，調控下游色素合成分子的表達[15，22]。綜上表明，lpa-miR-nov-66在調控羊駝黑色素細胞的黑色素生成路徑中，導致黑色素生成變化的直接原因是功能性的CDK5激酶引起TH發生磷酸化。這一結果補充lpa-miR-nov-66調控黑色素生成的分子機理。

4結論

lpa-miR-nov-66過量表達可引起功能性CDK5激酶的表達變化，從而使黑色素內TH的表達發生變化，引起下調黑色素的生成。

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(編輯程金華)

The Effect oflpa-miR-nov-66 onCDK5 Phosphorylation in Alpaca Melanocyte

ZHANG Jun-zhen，JI Kai-yuan，SHI Zhan-quan，LIU Yu，HU Shuai-peng，FAN Rui-wen*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:lpa-miR-nov-66；CDK5；TH；melanocyte

Abstract:The objective of this research was to investigate the effect oflpa-miR-nov-66 on cyclin dependent kinase 5 (CDK5) and its phosphoration on the pathway of melanogenesis in alpaca melanocytes.Following the transfection of alpaca melanocytes bylpa-miR-nov-66invitro，quantitative real-time PCR，immunocytochemistry，Western blotting and immunopricipitation were mainly used to determine the expression of the functionalCDK5.The results showed that compared to the control，the over expression oflpa-miR-nov-66 in melanocytes resulted in decreased expression ofCDK5 and increased expression of phosphotedCDK5 with significant difference (P<0.01)；P35 was the activator ofCDK5.And it was found thatCDK5-dependent phosphorylation of TH was up-regulated with the higher activity(P<0.05).The results suggested thatlpa-miR-nov-66 gave rise to up-regulation of phos-TH expression on the pathway of melanogenesis by functionalCDK5 binding toP35，which was the intermediate link for the molecular mechanism of regulating melanogenesis.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.011

收稿日期：2015-07-25

基金項目：國家自然科學基金(31201868)；山西省科技攻關項目(20120311024-2)

作者簡介：張俊珍(1972-)，男，碩士，副教授，主要從事畜禽生產的研究，Tel：0354-6288980，E-mail：junzhenzhang@163.com *通信作者：范瑞文，E-mail：ruiwenfan@163.com

中圖分類號：Q343

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0290-06