葉酸調控雞脾和胸腺IGF2表達的表觀遺傳機制探究

劉艷利，申　靜，支麗慧，李世召，姚軍虎，楊小軍

(西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

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葉酸調控雞脾和胸腺IGF2表達的表觀遺傳機制探究

劉艷利，申靜，支麗慧，李世召，姚軍虎，楊小軍*

(西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

摘要：本試驗旨在研究胚期注射葉酸對肉雞脾和胸腺中IGF2基因表達的影響，并進一步探究其調控基因表達的表觀遺傳學機制。選擇重量和大小相近的種蛋360枚，隨機分為4組，在孵化期第11天(E11)分別注射0(對照)、50、100和150 μg的葉酸。每個處理選取體重相近的48只1日齡雛雞，隨機分為6個重復，每個重復8只雞，在飼養的第21和42天取胸腺和脾組織。用RT-PCR方法檢測組織中IGF2的相對表達量；重亞硫酸鹽修飾克隆測序法(BSP)檢測IGF2啟動子區域(-648/-479 bp)甲基化水平；DNase I-qPCR方法檢測IGF2啟動子區域(-847/-616 bp)染色質構象。結果表明，胚期注射100和150 μg葉酸顯著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)；胚期注射150 μg葉酸顯著提高了42日齡脾中IGF2的表達量(P<0.05)、降低了42日齡脾中該基因啟動子區的甲基化水平(P<0.05)，并且也顯著增加了42日齡脾中IGF2啟動子區的染色質可接近度(P<0.05)；然而在21日齡時各葉酸處理組對脾中IGF2的表達均無顯著影響(P>0.05)。與脾組織不同，150 μg葉酸處理組顯著提高了21日齡胸腺中IGF2的表達(P<0.05)，對42日齡胸腺中該基因的表達卻沒有顯著影響(P>0.05)，并且與對照組相比，150 μg葉酸處理組中21日齡胸腺組織IGF2啟動子區的染色質可接近度也顯著增加(P<0.05)。由此可見，在種蛋孵化第11天注射葉酸可通過影響基因啟動子區的甲基化水平和染色質構象來調控組織中IGF2的表達，并且存在組織器官和時間特異性。

關鍵詞：葉酸；IGF2；甲基化；染色質構象；表觀遺傳

胰島素樣生長因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)基因位于雞第5號染色體，包括3個外顯子和2個內含子，其編碼的蛋白是一種促有絲分裂多肽，與胰島素具有相似的結構，對機體正常的生長發育，尤其是在調控胚胎發育上具有重要作用，也是一種胚胎生長因子[1-2]。許多在家禽上的研究均報道IGF2參與機體DNA和蛋白合成，在體內葡萄糖、能量甚至是脂質代謝中具有重要作用[3-4]，并且作為在選育過程中的一個候選基因，其與家禽的一些生產性狀例如肌肉及骨骼生長和腹脂率等存在一定的相關性[5-9]。然而關于IGF2在家禽中的表達調控機制卻鮮有報道。

近年來，隨著表觀遺傳學的提出，葉酸因具有攜帶活性甲基集團的功能，作為一碳單位代謝中重要的輔酶因子，有關其影響DNA甲基化的報道也越來越多。有研究報道，在妊娠和哺乳期給母鼠飼喂低葉酸含量的日糧，小鼠長大后其小腸組織中表現出全基因組DNA的低甲基化[10]。然而在斷奶后，給小鼠飼喂葉酸含量高的日糧，在結腸和直腸組織中依然發現DNA低甲基化狀態[11]。人類大量的流行病學中也涉及到葉酸與DNA甲基化之間的關聯，在結腸癌的患者中，葉酸促進了血清全基因組DNA的高甲基化[12]。通過限制絕經女性飲食中的葉酸含量，其白血球中的DNA出現低甲基化現象，并且有一定的劑量依賴效應[13]。體外培養雞脂肪前體細胞，探究葉酸如何影響家禽脂肪生成基因啟動子區DNA甲基化的試驗結果表明，未添加葉酸的試驗組中，C/EBPα基因啟動子區甲基化水平比添加16 mg·L-1的葉酸組降低21.8%，但PPAR基因啟動子區的甲基化在各試驗組中并沒有受到影響[14]。

家禽作為卵生動物，其孵化過程中胚胎發育所需要的營養素和能量不能像哺乳動物那樣來源于母體，均依賴于雞蛋中所積累的物質，因此鑒于家禽胚胎發育的特殊性和IGF2在機體組織生長發育和物質代謝中的重要性，并結合本實驗室前期工作[15]，本試驗通過在孵化期11胚齡注射不同劑量的葉酸，旨在以研究胚期注射葉酸能否影響肉雞脾和胸腺中IGF2基因的表達為依據，探討胚期營養調控基因表達的分子機制，為家禽營養表觀遺傳學研究建立基礎。

1材料與方法

1.1試驗設計

選取重量和大小相近的科寶500肉雞商品代種蛋360枚，隨機分為4個處理組并進行孵化。在孵化的第11天(E11)，向4個處理組種蛋的卵黃囊分別注射葉酸0、50、100和150 μg。葉酸溶液提前配制為相應的濃度，0 μg對照組注射的是生理鹽水，每個處理組注射體積均為0.1 mL。待出殼后，每個處理選取體重相近的48只小雞，隨機分為6個重復，每個重復8只雞。飼養期為42 d。

1.2受精蛋孵化率統計

種蛋孵化期間通過照蛋去除未受精蛋，記錄每個處理組去除的蛋數，待孵化期過后根據每組的出殼數計算受精蛋孵化率：受精蛋孵化率=出殼數/受精蛋數×100%。

1.3樣品采集

飼養的第21和第42天，在每個處理的每個重復中挑選1只與所在重復平均體重相近的雞只進行屠宰，收集脾和胸腺組織，立即放入液氮，隨后轉至-80 ℃保存待用。

1.4主要試劑和儀器

葉酸標準品和蛋白酶K購自Sigma公司；組織RNA提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；RNA反轉錄試劑盒、SYBR試劑盒和pMDTM19-T Vector購自TaKaRa公司；EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒購自美國Zymo公司；組織DNA提取試劑盒和DNA純化膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；細胞核提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；DNase Ⅰ和PCR純化試劑盒購自Thermo公司。

核酸定量分析儀(Nanodrop ND-1000)；實時熒光定量PCR儀(iQ5，Bio-Rad 公司)；離心機(Eppendorf)；37 ℃恒溫培養箱；恒溫搖床。

1.5RT-PCR檢測IGF2 mRNA相對表達水平

脾與肝中RNA的提取以及RNA反轉錄合成cDNA的過程均參照試劑盒說明書進行。實時熒光定量試驗使用TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，選用β-actin作為內參基因。基因的引物序列如下(5′-3′)：β-actin上游ATTGTCCACCGCAAATGCTTC，β-actin下游AAATAA-AGCCATGCCAATCTCGTC；IGF2上游AGACC-AGTGGGACGAAATAACA，IGF2下游CACGC-TCTGACTTGACGGAC。RT-PCR的反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算組織中IGF2的相對表達量[16]。

1.6BSP(Bisulfite sequencing PCR)克隆測序法檢測IGF2啟動子區甲基化水平

組織基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行，每個處理的6個DNA樣品兩兩隨機等量混合成為3個樣品。隨后450 ng的DNA被用來進行亞硫酸鹽修飾，具體操作參照EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒說明流程。被修飾的DNA經PCR擴增后電泳跑膠進行目的片段DNA的回收，目的產物純化后進行pMDTM19-T Vector克隆，每個樣品的克隆至少選取20個陽性菌落測序，用來檢測IGF2轉錄起始位點上游-648～-479 bp啟動子區域的甲基化水平。具體試驗流程參照V.P.Kovacheva等的方法[17]。BSP中PCR引物用Methprimer軟件進行設計(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)，序列如下(5′-3′)：上游TGGTTGTGTTGTAGATTTTT-TTTGT，下游ACACTAAATTTCACCTCCCAT-TTT。檢測甲基化的區域包含4個CpG位點，測序后最終每個位點的甲基化水平用在線的QUMA軟件分析(http：//quma.cdb.riken.jp/)，每個樣品選取13個轉化率在95%以上的克隆參與結果統計。

1.7DNaseⅠ-qPCR檢測IGF2啟動子區染色質疏松度

參照細胞核試劑盒說明書提取組織細胞核，細胞核的DNase I酶切消化參照前人的研究流程[18-20]。消化體系中的DNA用試劑盒進行純化回收后用于PCR擴增，檢測IGF2轉錄起始位點上游-847 ～-616 bp啟動子區域的染色質疏松度，所用引物序列如下(5′-3′)：上游CAGGTGGTGCTGCGATGAC，下游CGGAGATGGAGCCGAAGC。PCR擴增后，經過DNase I酶切消化的樣品的Ct值記為Ct (DNase+)，每個樣品所設的與之對應的未經過酶消化的Ct值記為Ct (DNase-)，染色質的疏松度用ΔCt=Ct (DNase+)-Ct (DNase-)表示。

1.8數據統計分析

利用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，試驗結果除了孵化率采用卡方檢驗外，其他均采用One-way ANOVA進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較，顯著性判斷標準均設置為P<0.05。

2結果

2.1胚期注射葉酸對受精蛋孵化率的影響

孵化期11胚齡注射葉酸對受精蛋孵化率的影響見表1，與對照組相比，50 μg葉酸注射組并沒有顯著影響受精蛋孵化率(P>0.05)，但100和150 μg葉酸組顯著提高了受精蛋孵化率(P<0.05)。

2.2胚期注射葉酸對雞脾和胸腺中IGF2表達的影響

孵化期11胚齡注射不同濃度葉酸后，各處理組21和42日齡雞脾與胸腺中IGF2表達量的分析如圖1和圖2所示，胚期不同的葉酸注射水平對21日齡脾和42日齡胸腺中IGF2的表達均無顯著影響(P>0.05)。但與對照組相比，150 μg葉酸注射組顯著提高了42日齡脾和21日齡胸腺組織中IGF2的表達(P<0.05)。

2.3胚期注射葉酸對IGF2啟動子區(-648/-479 bp)DNA甲基化的影響

如圖3和圖4所示，注射不同濃度的葉酸對21日齡脾中IGF2啟動子區甲基化水平沒有影響(P>0.05)。在42日齡，50和150 μg葉酸注射組脾中IGF2啟動區甲基化水平顯著降低(P<0.05)；與對照組(28.8%)相比，150 μg葉酸注射組(18.6%)甲基化水平降低了35.4%。胚期注射葉酸對胸腺IGF2啟動子區甲基化的影響見圖5和圖6，與脾組織不同，孵化期第11天100和150 μg葉酸的注射顯著增加了21日齡胸腺IGF2啟動子區的甲基化(P<0.05)，但所有葉酸處理組對42日齡基因啟動子區的甲基化均沒有顯著影響(P>0.05)。

表1胚期注射葉酸對種蛋孵化率的影響

Table 1Effects of folic acid injected on E11 on the hatchability of fertilized eggs

同列內肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters in the same column mean significant difference (P<0.05)

2.4胚期注射葉酸對IGF2啟動子區(-847/-616 bp)染色質構象的影響

孵化期注射葉酸對脾中IGF2啟動子區染色質可接近度的影響如圖7所示，150 μg葉酸注射組顯著增加了42日齡脾中該基因啟動子區染色質的可接近度(P<0.05)，而50和100 μg葉酸注射組對其并沒有顯著影響(P>0.05)；與對照組相比，21日齡3個葉酸注射組脾中IGF2啟動子區染色質構象均沒有顯著變化(P>0.05)。由圖8可知，僅150 μg葉酸注射組顯著增加了21日齡胸腺IGF2啟動子區染色質可接近度(P<0.05)，各葉酸處理組對42日齡胸腺該基因啟動子區染色質構象均無顯著影響(P>0.05)。

2.5IGF2啟動子區轉錄因子預測

采用在線軟件(http：//www.genomatix.de)對本試驗所涉及的IGF2啟動子區域進行轉錄因子預測，結果如圖9所示，圖9A預測的區域包含本試驗所檢測的4個CpG位點，共預測出7個轉錄因子。圖9B預測的是IGF2啟動子染色質構象所在的區域，軟件預測的結果顯示共有39個轉錄因子。

3討論

李世召等[21]指出，種蛋注射技術在家禽上已經得到了廣泛應用，很多研究學者通過在孵化期注射營養素或疫苗來提高機體的生產性能和免疫功能。有研究表明，在雞胚孵化期11天注射3 mg維生素C能顯著提高種蛋孵化率[22]，與本試驗中注射葉酸提高受精蛋孵化率結果一致，說明注射并沒有對雞胚產生危害，并且注射的營養素對孵化率起到積極作用。

本研究結果表明，孵化期150 μg葉酸的注射提高了42日齡脾中和21日齡胸腺中IGF2的mRNA表達，雖然沒有關于葉酸在家禽上調控IGF2表達的報道，但有研究表明，IGF2在五指山豬8個組織中的表達量呈時序性變化，并且也存在組織差異[23]。因此葉酸在家禽中上調IGF2的表達可能也存在時間和組織的特異性。

目前，基因表達調節的表觀遺傳學機制并不完全明晰，有觀點認為基因啟動子區域的甲基化能通過阻礙轉錄因子的結合來抑制基因的表達[24]。除此之外，染色質結構的重塑也參與基因的表達調控，啟動子區域染色質結構的疏松度與基因的表達成正相關[18]。而葉酸在一碳單位的代謝中扮有重要角色，與甲基集團的轉移有關，參與DNA和組蛋白的甲基化過程。本試驗中，150 μg葉酸組顯著降低了42日齡脾中IGF2啟動子區域的甲基化，并提高了啟動子區域的染色質疏松度，與該日齡組織中IGF2表達的上調相對應。膽堿與葉酸在一碳單位代謝中具有類似的功能，有研究表明，通過給孕期母鼠飼喂高膽堿日糧，能夠降低小鼠肝中IGF2基因調控區域的甲基化[17]，與本試驗中葉酸降低脾IGF2啟動子區甲基化的結果相似，并且有研究認為，CpG的甲基化能夠通過轉錄抑制復合子來誘導組蛋白的去乙酰化，進而影響染色質的重塑來沉默基因的表達[25]。通過對IGF2啟動子區域進行轉錄因子預測發現，在本試驗中所涉及到的DNA甲基化和染色質構象測定區域均存在轉錄因子結合位點，表明葉酸有可能通過改變DNA甲基化來影響轉錄因子的結合進而調控IGF2的表達。

與脾組織不同的是，葉酸對胸腺IGF2的表達、基因啟動子甲基化以及構象的影響均體現在21日齡上，雖然150 μg葉酸組對21日齡胸腺IGF2的表達和IGF2啟動子染色質構象的影響與對42日齡脾組織的影響結果相同，但對IGF2啟動子區甲基化的影響結果卻完全相反。體外培養雞的脂肪前體細胞研究表明，添加16 mg·L-1葉酸的試驗組C/EBPα基因啟動子區甲基化水平與對照組相比升高了21.8%[14]，與本試驗中葉酸提高21日齡胸腺IGF2啟動子區甲基化的結果一致，這就表明在21日齡胸腺中，IGF2的表達雖然受啟動子區甲基化和染色質構象的影響，但染色質構象更占主導地位。

5-甲基四氫葉酸因其結構的特殊性，可攜帶活性甲基集團，作為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成的甲基提供者，通過對DNA甲基化作用，改變表觀遺傳，故葉酸參與調控DNA甲基化已得到普遍共識[26]。但在不同動物、不同細胞以及不同目的基因中，葉酸對DNA甲基化的影響結果卻不盡相同[27-28]。機體中，SAM合成所需要的甲基也可來源于其他營養素例如膽堿和甜菜堿，并且SAM接收來自葉酸最終攜帶的甲基基團的過程中也受很多輔酶因素(維生素B2、B6和B12等)的制約[29]，也有研究稱葉酸的添加可能會打破細胞內一碳單位的代謝[30]。因此，葉酸對組織IGF2啟動子區甲基化的影響出現不同的結果可能與日齡以及組織的不同有關。

除此之外，雖然基因的表達與其啟動子區的甲基化和染色質構象有關，但甲基化與染色質構象之間的內在關系至今仍沒有明確定論，有學者認為，甲基化的DNA能夠招募甲基胞嘧啶結合蛋白2(MeCP2)，此蛋白有一個轉錄抑制結構域(TRD)，它能結合另一個抑制子蛋白mSin3A，mSin3A蛋白是包括組蛋白去乙酰化酶在內的多重蛋白復合體的結構中心，能使組蛋白去乙酰化，從而改變染色質構象[25]。本試驗中，葉酸雖然提高了21日齡胸腺IGF2啟動子區的甲基化水平，但染色質疏松度反而升高，故在不同的組織中，葉酸通過甲基化和染色質構象調控IGF2表達可能存在不同的機制，本試驗結果預測到IGF2啟動子區有轉錄因子結合位點的存在，但在家禽上有關表觀遺傳調控基因表達的研究較少，是否葉酸是通過轉錄因子為中介并連結DNA甲基化和染色質構象來調控基因轉錄有待將來進一步的深入研究。

4結論

在雞胚孵化第11天注射葉酸能夠通過改變IGF2啟動子區甲基化和染色質構象來調控脾和胸腺中IGF2的表達，但存在組織和時間特異性，啟動子區甲基化與染色質構象改變的內在聯系有待進一步研究。

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(編輯郭云雁)

The Study on Epigenetic Mechanism ofIGF2 Expression in Spleen and Thymus Regulated by Folic Acid in Broilers

LIU Yan-li，SHEN Jing，ZHI Li-hui，LI Shi-zhao，YAO Jun-hu，YANG Xiao-jun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Key words:folic acid；IGF2；methylation；chromatin structure；epigenetics

Abstract:The study was conducted to investigate the effects of folic acid injected in incubation period onIGF2 expression in spleen and thymus in broilers，further exploring epigenetic mechanism of folic acid modulating gene expression.A total of 360 eggs，whose weight and size were mostly same，were selected and randomly assigned to 4 treatments.0，50，100 and 150 μg folic acid were injected into eggs，respectively on E11 of incubation.After hatching，48 healthy 1-day-old chickens selected from each treatment were divided into 6 replicates and 8 birds each.Spleens and thymus were collected at the age of 21 and 42 d.The mRNA expression ofIGF2 were tested by RT-PCR；BSP was used to determine the methylation level ofIGF2 gene promoter region from -648 to -479 bp and DNase I-qPCR for chromatin structure of theIGF2 promoter from -847 to -616 bp.The results were shown as followed：100 and 150 μg folic acid groups improved hatchability of fertilized eggs(P<0.05)；150 μg folic acid injected on E11 significantly up-regulatedIGF2 expression in spleen (P<0.05) and reduced methylation level of gene promoter at the age of 42 d (P<0.05)；Chromatin accessibility ofIGF2 promoter region was improved in 150 μg folic acid group at the age of 42 d(P<0.05)in spleen.Different from spleen，150 μg folic acid didn’t affectIGF2 expression in thymus at the age of 42 d(P>0.05)but significantly increased gene expression in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Compared with the control group，150 μg folic acid improved chromatin accessibility ofIGF2 promoter in thymus at the age of 21 d(P<0.05).Overall，the results indicated that folic acid injected on E11 could affectIGF2 expression in tissues by altering methylation level and chromatin structure of gene promoter，and there exists specificity on organs and time.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.012

收稿日期：2015-04-13

基金項目：國家自然科學基金項目(31272464)；教育部新世紀優秀人才項目(NCET-12-0476)；陜西省農業攻關計劃(2014k01-18-02；2015NY149)；陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2015KTCQ02-19)

作者簡介：劉艷利(1993- )，女，河南伊川人，碩士生，主要從事畜禽免疫營養調控與營養表觀遺傳調控相關研究，E-mail：1085752204@qq.com *通信作者：楊小軍，教授，E-mail：yangxj@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號：S831.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0296-09