GP5Δ84-119穩定表達對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的影響

王曉紅，宋林林，李亮亮，袁傳奇，姜　博，周恩民*，穆　楊*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.農業部獸用藥物與獸醫生物技術陜西省科學觀測實驗站，楊凌 712100)

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GP5Δ84-119穩定表達對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的影響

王曉紅1，2，宋林林1，2，李亮亮1，2，袁傳奇1，2，姜博1，2，周恩民1，2*，穆楊1，2*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100；2.農業部獸用藥物與獸醫生物技術陜西省科學觀測實驗站，楊凌 712100)

摘要：為探討豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)主要結構蛋白GP5的第二胞外區在病毒復制中的作用及機制，利用PiggyBac Transposon System Vectors構建了表達刪除84—119氨基酸殘基的截短型GP5的重組質粒(pPB-GP5Δ84-119)，轉染Marc-145細胞通過嘌呤霉素抗性篩選和3次亞克隆，篩選穩定表達GP5Δ84-119的Marc-145細胞系，并利用cck-8試劑盒檢測細胞的增殖情況；用PRRSV SD16株感染篩選的細胞，通過病毒基因拷貝數和病毒滴度檢測GP5Δ84-119表達對PRRSV復制影響；通過Real-time PCR和ELISA檢測病毒感染前后細胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表達情況。經RT-PCR、Western blot和IFA檢測，GP5Δ84-119在Marc-145細胞中獲得穩定表達，將此細胞命名為Marc-145-GP5Δ84-119；細胞增殖曲線顯示GP5Δ84-119的表達不影響細胞的增殖；對病毒基因拷貝數和病毒滴度檢測發現GP5Δ84-119的表達可以抑制PRRSV的復制，這種抑制作用可能是通過上調IFN特別是IFN-β的表達而實現的。研究表明GP5第二胞外區在PRRSV復制中發揮重要作用。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；GP5Δ84-119；穩定表達；復制；干擾素

The Effect of GP5Δ84-119Stable Expression on the Replication of

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又名豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染所致的一種高度接觸性傳染病。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續性感染為主要特征，是當今世界對養豬業經濟影響最重要的疾病之一。PRRS于1987年首先在北美洲被發現并報道，隨后該病在加拿大、德國、荷蘭等國家及地區相繼暴發，目前已呈全球性分布。S.J.Tousignant等對2009—2013年4 年間美國14 個豬場371個豬群PRRS發病率和時空動態分析顯示，PRRSV在美國的危害仍持續存在[1]。1996年郭寶清等首次分離到PRRSV中國株CH-1a[2]。之后該病在我國的流行和分布日益廣泛，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失，特別是2006年主要由高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)變異株引起的高致病性PRRS (HP-PRRS)給我國養豬業造成的打擊幾乎是毀滅性的[3-6]。鑒于該病對我國養豬業的巨大危害，農業部現已將其列為一類動物疫病。由于PRRSV的嗜巨噬細胞性、抗體依賴性增強作用(antibody-dependent effect，ADE)和持續性感染等特征，目前對該病的致病機制和免疫機制仍不完全清楚，現有疫苗防控PRRSV感染的效果也不理想。

PRRSV屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒基因組長度約為15 kb，由9個相互重疊的開放閱讀框(open reading frame，ORF)組成，其5′末端有帽子狀引導序列，3′末端有Poly(A)尾序列，從5′端到3′端依次為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[7]。ORF1 由ORF1a 和ORF1b 組成，位于基因組的5′端，約占整個基因組的80%，主要編碼病毒RNA復制酶和聚合酶。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5依次編碼糖基化的囊膜蛋白GP2a、E、GP3、GP4和GP5[8]，ORF6和ORF7分別編碼膜基質蛋白(matrix protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)[9]。ORF5編碼的GP5是PRRSV的一種糖基化囊膜蛋白，相對分子質量約為25 ku，具有高度變異性，美洲型毒株和歐洲型毒株的GP5分別由200和201個氨基酸殘基組成。成熟的GP5由氨基端信號肽(1-31 aa)、胞外區、三次跨膜的疏水區和位于胞質中的親水性羧基端組成[8，10-12]。GP5在病毒的組裝、入侵和誘導機體產生免疫應答方面發揮著重要作用。三次跨膜的GP5 在病毒囊膜上形成兩個胞外區，美洲型毒株位于第一胞外區氨基端的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位點在不同毒株間高度保守。在LV毒株，46位天冬酰胺(Asn)的糖基化對病毒的組裝和感染性是必要的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要。有關第二胞外區與病毒復制的關系，目前還未見相關報道。本研究通過建立穩定表達缺失84-119氨基酸殘基(第二個胞外區)的截短型GP5的Marc-145細胞系，研究GP5Δ84-119表達對PRRSV復制的影響及機制，為進一步研究GP5的功能及PRRSV的致病機制積累資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病毒、質粒、載體和細胞PRRSV SD16株(GenBank Access No.JX087437.1)、Marc-145細胞系由西北農林科技大學獸醫免疫生物學實驗室保存；pMD18-T-GP5、pMD18-T-N質粒，Marc-145-GP5、Marc-145-GFP細胞系由西北農林科技大學獸醫免疫生物學實驗室構建、鑒定并保存；E.coliDH5α感受態細胞、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；PiggyBac transposon vector system為SBI公司產品。

1.1.2主要試劑質粒提取試劑盒、膠純化試劑盒為北京全式金生物技術公司產品，RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real time)、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、ExTaqVersion 2.0 plus dye為TaKaRa公司產品，T4 DNA連接酶、BamHⅠ、EcoRⅠ為NEB公司產品，FastStart Universal SYBR Green Master為Roche公司產品，PageRuler Prestained Protein ladder、BCA蛋白質測定試劑盒為Thermo Scientific公司產品，X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent為Roche公司產品，嘌呤霉素(puromycin)為Merck公司產品，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG、TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG為Jackson ImmunoResearch公司產品，Cell counting kit-8(cck-8)為碧云天生物技術公司產品，抗α-tubulin單克隆抗體為Sigma公司產品，抗PRRSV GP5小鼠血清、抗PRRSV N蛋白單克隆抗體6D10、抗PRRSV豬陽性血清由西北農林科技大學獸醫免疫生物學實驗室制備并保存；Monkey Interferon α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ ELISA kit (Catalog# CSB-E10040Mo、CSB-E17829Mk、CSB-E110049Mo) 為CUSABIO公司產品。

1.2引物設計合成與重組質粒構建

參照PRRSV SD16株GP5編碼序列利用Primer 5.0設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。采用PCR方法從pMD18-T-GP5質粒上分別用引物GP51-83-F與GP51-83-R、GP5120-201-F與GP5120-201-R擴增編碼GP5 1—83和120—201氨基酸殘基所對應的基因序列片段，膠回收PCR產物，再采用Overlap PCR方法以編碼GP5 1—83和120—201氨基酸殘基的基因序列片段為模板，用引物GP5-F和GP5-R擴增編碼GP5Δ84-119(刪除84—119氨基酸殘基的GP5)的序列片段。膠回收目的片段，將目的片段與PB transposon plasmid用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收、連接、轉化E.coliDH5α感受態細胞、培養挑取單克隆，將菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性的質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序正確的質粒命名為pPB-GP5Δ84-119(圖1)。

表1引物信息

Table 1The information of primers

下劃線部分為EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點序列

The underlined areEcoRⅠ andBamHⅠ restriction enzyme sequences

1.3質粒轉染與細胞篩選

將狀態良好的Marc-145細胞按每孔2×105個細胞鋪于6孔細胞培養板培養，待細胞達到80%左右融合度時用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 將donor plasmid (pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector)和helper plasmid(PiggyBac Transposase vector)轉染細胞，同時設僅轉染PB Transposon vector的對照。轉染后24～48 h觀察。若僅轉染PB Transposon vector的孔無熒光，而其他孔均有熒光，則更換新鮮培養液并向培養液中加入終質量濃度為10 ng·μL-1的嘌呤霉素開始進行篩選培養，每2 d更換一次含嘌呤霉素的培養液，大約10 d左右在熒光顯微鏡下看到帶綠色熒光的細胞團出現時連續進行3次亞克隆，將獲得的表達綠色熒光的單克隆細胞及時進行凍存。然后更換為無嘌呤霉素的培養液培養并進行外源基因表達檢測。

1.4篩選細胞的鑒定

1.4.1RT-PCR鑒定收獲正常培養的篩選細胞，用RNAiso plus提取細胞總RNA，取1 μg RNA 用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄為cDNA，以獲得的cDNA為模板用GP51-83-F和GP5120-201-R進行PCR擴增，同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。反應結束后取5 μL PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統分析結果。

1.4.2Western blot鑒定收集1×106個正常培養的篩選細胞，按NP40裂解液說明裂解細胞準備樣品進行12%分離膠 SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白質轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜后將膜轉入抗PRRSV GP5小鼠血清(0.5 ng·μL-1)或抗α-tubulin單克隆抗體(0.25 ng·μL-1)中4 ℃孵育過夜，次日洗膜后將膜放入HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(0.08 ng·μL-1)中，室溫孵育1 h，洗膜后用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(TianGen)顯色并記錄結果。同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。

1.4.3激光共聚焦顯微鏡分析將篩選細胞與Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP按1×104·孔-1分別接種于鋪有爬片的24孔細胞培養板，培養24 h后用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min，冷PBS洗3次后用含0.3%Triton X-100、1% BSA的PBS室溫透膜3 min，洗滌后用含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，洗滌后以抗PRRSV 陽性豬血清(1∶300稀釋)為一抗室溫孵育細胞2 h，洗滌，以TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG(70 ng·μL-1)為二抗室溫孵育1 h，PBS洗1次，然后用DAPI染細胞核2 min，PBS洗3次，雙蒸水洗1次，Fluorescence mounting medium(Dakota，CA，USA)封片，激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R，Japan)觀察，同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。

將RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微鏡分析均為陽性的細胞命名為Marc-145-GP5Δ84-119。

1.5細胞增殖曲線測定

用培養液調整Marc-145-GP5Δ84-119濃度，每孔2×103個細胞接種96孔板培養，分別于培養的24、48、72、96、120、144和168 h在每個測定點前2 h，每孔加入10 μL cck-8溶液，輕輕混勻后繼續培養2 h，用酶標儀讀取450 nm波長處吸光度值，每個時間點設置6個重復孔，同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。

1.6PRRSV GP5Δ84-119表達對病毒復制影響檢測

將Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接種于24孔細胞培養板培養，待細胞融合度達到80% 時，按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后換成3% FBS的DMEM維持液，接毒后12、24、36、48、60 h分別收集細胞和培養液上清，每個時間點設3個重復。用RNAiso plus提取細胞總RNA，取500 ng RNA用PrimeScriptTMRT reagent kit反轉錄合成cDNA。以pMD18-T-N為標準品10倍稀釋制作標準曲線，采用Real-time PCR對樣品進行檢測，參考標準曲線計算每個樣品中N基因的拷貝數。將收集的培養液上清用不含血清DMEM作10倍稀釋，按Reed-Muench法用Marc-145細胞測定培養液上清中的病毒滴度(TCID50mL-1)，同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。

1.7IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達檢測

1.7.1Real-time RT-PCR檢測IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA水平將Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接種于24孔細胞培養板，待細胞融合度達到80% 時，按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后換成3% FBS的DMEM維持液，接毒后12、24、36、48 h分別收集細胞，通過Real-time RT-PCR檢測各樣品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA的轉錄情況，同時設Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對照。

1.7.2IFN蛋白表達檢測將Marc-145-GP5Δ84-119細胞按1×104·孔-1接種96孔細胞培養板，分別收集培養24和48 h的培養液上清，同時待細胞達80%融合度時按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃ 吸附1 h，更換為含3% FBS的DMEM維持液繼續培養。收集接毒后24和48 h的培養液上清，每個時間點設3個重復。用Monkey IFN-α、IFN-β和 IFN-γ ELISA 試劑盒檢測收集的培養液上清中各IFN蛋白的表達。

1.8數據處理

用GraphPad prism 5 對數據進行處理，P<0.05表示有顯著差異，P<0.001表示有極顯著差異。

2結果

2.1重組質粒構建

以pMD18-T-GP5質粒為模板，先分別擴增編碼PRRSV GP5 1—83氨基酸殘基和120—200氨基酸殘基的基因片段，再以回收的目的片段為模板通過 Overlap PCR方法擴增編碼刪除84—119氨基酸殘基的GP5基因片段(圖2A)，回收目的片段與PB Transposon vector連接后構建重組質粒，通過菌液PCR和EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定(圖2B)后測序結果顯示，編碼刪除84—119氨基酸殘基的截短型GP5基因片段被正確插入PB Transposon vector中(圖2C)。

2.2穩定表達GP5Δ84-119細胞的篩選與鑒定

將pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector 和PiggyBac Transposase vector共轉染Marc-145細胞，轉染后24 h觀察到微弱的綠色熒光，48 h綠色熒光已比較明亮，72 h開始用含嘌呤霉素的培養液進行篩選培養，10 d左右時觀察到帶熒光的細胞團，經3次亞克隆后獲得全部表達綠色熒光的細胞克隆(圖3A)。采用RT-PCR方法可以從篩選的細胞中擴增到495 bp的目的條帶，從Marc-145-GP5細胞中擴增到603 bp的GP5 基因片段，而Marc-145和Marc-145-GFP均無擴增條帶(圖3B)。Western blot結果顯示，篩選細胞的泳道有20 ku左右的印跡條帶，Marc-145-GP5細胞的泳道有25 ku左右的印跡條帶，而Marc-145和Marc-145-GFP細胞的泳道均無條帶(圖3C)。激光共聚焦顯微鏡分析發現，與GP5一樣，GP5Δ84-119主要表達于細胞質中(圖4)。

篩選的細胞在無嘌呤霉素的培養液中連續傳50代以上檢測，目的基因的表達依然穩定。以上結果表明獲得了穩定表達PRRSV GP5Δ84-119的Marc-145細胞系Marc-145-GP5Δ84-119。

2.3Marc-145-GP5Δ84-119增殖測定

采用cck-8試劑盒檢測細胞的增殖狀況，結果顯示，與Marc-145和Marc-145-GFP相比，穩定表達GP5Δ84-119對Marc-145細胞的增殖無明顯影響，從細胞接種到對數生長期，Marc-145-GP5Δ84-119的增殖與Marc-145和Marc-145-GFP無差異，僅培養到120 h以后，Marc-145-GP5Δ84-119比Marc-145和Marc-145-GFP早進入平臺期(圖5)。

2.4GP5Δ84-119穩定表達對PRRSV復制的影響

接種PRRSV SD16株后12、24、36、48和60 h分別收集細胞和培養液上清。提取細胞總RNA，以pMD18-T-N質粒為標準品，通過絕對實時熒光定量RT-PCR檢測PRRSVN基因拷貝數。PRRSV感染后12 h，Marc-145-GP5和Marc-145-GP5Δ84-119細胞中N基因拷貝數略有增加，且與Marc-145細胞相比差異顯著，但從感染后24 h直到檢測的60 h，Marc-145-GP5Δ84-119細胞中N基因拷貝數顯著低于Marc-145細胞中的 (P<0.05或P<0.01)(圖6A)，培養液上清中的病毒滴度從感染后24 h也持續低于Marc-145和Marc-145-GFP細胞培養上清中的病毒滴度(P<0.05)(圖6B)。表明GP5Δ84-119穩定表達可以抑制病毒的復制。

2.5IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達檢測

為了探究GP5Δ84-119穩定表達抑制PRRSV SD16株復制的可能原因，在病毒感染后12、24、36和48 h收集細胞，提取細胞總RNA，通過熒光定量RT-PCR檢測各樣品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉錄情況，并采用ELISA試劑盒檢測病毒感染后24和48 h培養液中IFN-α、 IFN-β和 IFN-γ蛋白的含量。結果發現，與Marc-145細胞相比，病毒感染Marc-145-GP5Δ84-119后12 h，IFN-α、IFN-β的mRNA轉錄有所下降，IFN-γ mRNA轉錄變化不明顯，到24和36 h，IFN-α(4.09倍和4.98倍)和IFN-β(10.18倍和10.02倍) mRNA轉錄均出現了大幅度升高，特別是36 h，IFN-γ(5.72倍)mRNA的轉錄也出現上調，但到48 h，僅檢測到IFN-β(1.82倍)mRNA轉錄仍然處于上調狀態(圖7A)。檢測IFN-α、IFN-β和 IFN-γ蛋白表達水平發現，與Marc-145細胞相比，正常培養48 h的 Marc-145-GP5Δ84-119細胞中，IFN-β蛋白水平升高明顯，IFN-α和 IFN-γ在正常培養24和48 h都出現了不同程度的變化，但變化幅度較IFN-β均比較小；病毒感染后24和48 h，與Marc-145細胞和Marc-145-GFP細胞上清中IFN-β表達相比，Marc-145-GP5Δ84-119細胞上清中IFN-β蛋白表達一直維持在較高水平，由此推測IFN-β表達上調可能是GP5Δ84-119穩定表達抑制PRRSV復制的原因之一，是否還有其他因素導致GP5Δ84-119穩定表達抑制病毒復制，有待進一步研究。

3討論

病毒感染敏感細胞包括吸附、侵入、脫殼、病毒成分合成、病毒粒子組裝和釋放等步驟。PRRSV感染 PAM 開始于與巨噬細胞膜上硫酸乙酰肝素(heparin sulphates，HS)、黏多糖(Glycosaminoglycans，GAGs)的結合，隨后病毒通過 M/GP5 復合物與唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn)的氨基端結合，繼而病毒受體復合物經網格蛋白介導的內吞作用被內化，然后病毒基因組從早期內體釋放于細胞質并開始病毒的復制[13]。GP5、M 和 N 蛋白對病毒粒子的組裝和釋放是絕對必須的，但共表達 PRRSV 同科的馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)的 GP5、M 和 N 蛋白并不能在培養液中形成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)，說明其他非結構蛋白或宿主蛋白對病毒粒子的形成和釋放是必須的[14]。缺少次要囊膜蛋白雖然可以形成病毒粒子，但形成的病毒粒子沒有感染性[15]。GP5是一種糖基化囊膜蛋白，具有高度變異性，美洲型毒株和歐洲型毒株的GP5分別由200和201個氨基酸殘基組成。成熟的GP5由氨基端信號肽(1—31 aa)、胞外區、三次跨膜的疏水區和位于細胞質中的親水性羧基端組成[8，10-12]。位于美洲型毒株第一胞外區的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位點在不同毒株間高度保守。46位天冬酰胺(Asn)的糖基化對LV毒株的組裝和感染性是絕對必須的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要[16]。對于GP5第二胞外區在病毒復制中的作用目前卻鮮見報道。

本研究在預測PRRSV SD16 株GP5跨膜結構的基礎上(圖1)，構建表達刪除GP5第二個跨膜區(aa 84-119)的重組質粒，在構建重組載體時，作者選擇了PiggyBacTMTransposon Vector System，利用此載體構建的重組質粒轉染細胞后，在轉染細胞中表達的目的蛋白質與標簽蛋白是分離的[17]，在分析目的蛋白質的功能時，不會受到標簽蛋白的影響。用重組質粒轉染Marc-145細胞通過嘌呤霉素抗性篩選和3次亞克隆獲得了穩定表達GP5Δ84-119的細胞系Marc-145-GP5Δ84-119，通過RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測，GP5Δ84-119在Marc-145細胞中獲得了穩定表達。篩選的細胞在光學顯微鏡下與其祖代細胞Marc-145細胞形態相似(圖3A)，Western blot檢測時出現兩條印記條帶，這與報道的GP5蛋白存在不同的糖基化形式相一致[18-19]。 激光共聚焦顯微鏡檢測表明，表達的GP5Δ84-119主要存在于細胞質中(圖4)。利用Cell Counting Kit-8檢測細胞的增殖情況表明，GP5Δ84-119穩定表達不影響Marc-145細胞的增殖(圖5)。

作為 PRRSV 最主要的結構蛋白之一，GP5 在病毒的侵入、組裝和誘導機體產生免疫應答等方面發揮著重要作用[15，20]。在課題組前期構建的穩定表達GP5全長的細胞系Marc-145-GP5上，GP5穩定表達在病毒感染早期可以通過下調 IFN(特別是IFN-β)的表達促進病毒的復制。在Marc-145-GP5Δ84-119上接種PRRSV SD16株后不同時間分別收集培養液上清和細胞，檢測細胞中的病毒基因拷貝數和上清中的病毒滴度，發現除接毒后12 h病毒復制稍有增加外，一直到接毒后60 h，病毒的復制被明顯抑制，細胞中PRRSVN基因拷貝數和上清中PRRSV滴度均顯著低于Marc-145細胞和空載體對照Marc-145-GFP細胞的(圖6)。研究報道，IFN-α、IFN-β和IFN-γ 具有抗PRRS病毒的效應[21-24]。本研究發現，與Marc-145細胞相比，PRRSV感染 Marc-145-GP5Δ84-119后，IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉錄在24和48 h均出現不同程度的上調，IFN-β蛋白表達也顯著升高(圖7)，由此推測干擾素特別是IFN-β表達的上調可能是GP5Δ84-119穩定表達抑制PRRSV復制的原因之一。Z.Wei等指出GP5蛋白胞外區存在的N連接的糖基化位點對病毒在體內的復制至關重要[25]。aa 84-119 包括了GP5蛋白的第二個胞外區和部分胞內區 (圖1)。穩定表達刪除此區域的截短型GP5，PRRSV在此細胞上的復制被顯著抑制，此區域是否也存在一些關鍵的氨基酸位點在病毒的復制中發揮重要作用以及是否還有其他因素發揮了GP5Δ84-119穩定表達抑制PRRSV復制的作用，還有待進一步研究。

4結論

構建了表達刪除84—119氨基酸殘基的 PRRSV GP5(GP5Δ84-119)的重組質粒，轉染Marc-145細胞篩選到穩轉細胞系Marc-145-GP5Δ84-119，GP5Δ84-119在Marc-145細胞中的穩定表達可以抑制PRRSV SD16株的復制，IFN表達的上調可能是GP5Δ84-119穩定表達抑制病毒復制的原因之一。

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(編輯白永平)

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Xiao-hong1，2，SONG Lin-lin1，2，LI Liang-liang1，2，YUAN Chuan-qi1，2，JIANG Bo1，2，ZHOU En-min1，2*，MU Yang1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.ScientificObservingandExperimentalStationofVeterinaryPharmacologyandVeterinaryBiotechnology，MinistryofAgriculture，Yangling712100，China)

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome virus；GP5Δ84-119；stable expression；replication；interferon

Abstract:This experiment was conducted to study the role of the second extracellular domain of glycoprotein 5，one major structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)，on PRRSV replication and approach to its mechanism in Marc-145 cells.A recombinant plasmid (named as pPB-GP5Δ84-119) expressing truncated GP5 was constructed using PiggyBac Transposon System Vectors and transfected to Marc-145 cells.Marc-145 cell line stably expressing GP5Δ84-119was obtained by puromycin resistance screening and triple subcloning and the selected cells proliferation was detected using cck-8 kit.The effect of GP5Δ84-119stable expression on PRRSV replication were determined thought detection of virus gene copy number in the infected cells and virus titers in the supernatant of infected cells.What’s more，the mRNA and protein expression levels of IFN-α，IFN-β，IFN-γ in the cells before and after PRRSV infection were also analyzed using Real-time PCR and ELISA.The results of RT-PCR，Western blot and IFA confirmed that GP5Δ84-119was stablely expressed in Marc-145 cells and the cells were named as Marc-145-GP5Δ84-119.The result of cell proliferation assay confirmed that the expression of GP5Δ84-119did not affect the proliferation of Marc-145 cells.It was found that GP5Δ84-119expression inhibited the replication of highly pathogenic PRRSV in Marc-145 cells through upregulating IFN level，especially IFN-β.These findings suggest that the second extracellular domain of GP5 plays an important role in PRRSV replication.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.014

收稿日期：2015-06-20

基金項目：國家自然科學基金青年項目(31201883)；中央高校基本科研業務費(2014YB010；2452015318)

作者簡介：王曉紅(1988-)，女，陜西寶雞人，碩士生，主要從事重大動物疫病發病機制研究，Tel：029-87091117，E-mail：13152427862@163.com *通信作者：周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；穆楊，E-mail：muyang@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0315-10