禽呼腸孤病毒強毒株和弱毒疫苗株感染Vero細胞的蛋白質組學研究

黃　莉，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，范　晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，王　盛

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，南寧 530001)

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禽呼腸孤病毒強毒株和弱毒疫苗株感染Vero細胞的蛋白質組學研究

黃莉，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，范晴，羅思思，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，王盛

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，南寧 530001)

摘要：為研究在禽呼腸孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同時間點宿主細胞中蛋白質組變化，運用雙向凝膠電泳技術和質譜鑒定的蛋白質組學方法，對ARV 強毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero細胞和對照細胞在不同時間點的蛋白質樣品進行檢測。鑒定結果表明，共鑒定出44個差異表達蛋白質，這些蛋白質包括α-烯醇化酶(α-enolase)、過氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、轉錄延伸因子等。 GO軟件分析顯示這些差異蛋白質主要參與細胞信號、細胞骨架組成、能量代謝、核酸代謝、蛋白質折疊、細胞增殖及凋亡等生物學功能。熒光定量RT-PCR驗證表明，hnRNP和Prx-4在S1133感染細胞中表達水平持續上調，而Tubulin 和α-enolase 僅分別在48和24 h時表達上調，與雙向凝膠電泳的結果一致。以上試驗數據揭示了ARV不同毒力毒株感染后細胞中蛋白質表達的差異變化，有助于進一步闡明ARV和宿主之間的相互作用。

關鍵詞：禽呼腸孤病毒；強毒株；弱毒疫苗株；Vero細胞；差異表達蛋白質

禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV) 主要引起病毒性關節炎/腱鞘炎、矮小綜合征及吸收不良綜合征等，尤為嚴重的是誘發免疫抑制，造成機體對疫苗免疫應答能力和各種病原體抵抗力降低[1-3]。近年來，中國大多數省、區、市都有ARV感染的報道，其雞群感染率可高達50%以上，已經成為雞場中禽類免疫抑制病的主流，造成養禽業的經濟損失，嚴重危害養禽業的健康發展[4-5]。ARV對宿主細胞的感染過程是病毒和宿主之間相互作用的結果和體現，會引起宿主細胞蛋白質表達模式發生改變。不同毒力的病毒感染宿主細胞后可導致宿主細胞啟動不同的防御機制和蛋白質分子表達模式[6-7]。因此，利用蛋白質組學研究技術分析比較ARV強弱毒株感染前后宿主細胞蛋白質的表達變化，將為研究提供一個全新的視角來認識ARV與宿主細胞的相互作用關系，有助于在細胞水平上揭示病毒毒力不同對宿主細胞調控的差異，以及宿主細胞對此采取的相應應對策略，也有利于進一步闡明ARV感染機制。

隨著近年來雙向凝膠電泳方法、質譜鑒定等蛋白質組學技術的不斷發展和日益完善，蛋白質組學研究已經成為研究病毒與宿主之間相互作用關系的有效高通量工具，并且在家禽病毒的研究中得到廣泛應用，促進了家禽病毒研究的高速發展[8]。吳雙等采用比較蛋白質組學方法，分析新城疫病毒不同毒力毒株感染雞胚成纖維細胞后宿主蛋白質的表達變化，驗證了新城疫病毒可以胞吞方式進入細胞，進而實現病毒的感染[9]。盧占軍利用蛋白質組學技術研究馬立克病毒超強毒株感染雞法氏囊的蛋白質表達情況，篩選出與馬立克病毒感染相關的一些重要宿主蛋白質，為深入研究馬立克病致病性和致瘤性奠定基礎[10]。ARV S1133是禽呼腸孤病毒的標準毒株，可以感染致病雞群；而ARV aS1133是ARV S1133經雞胚弱化形成的弱毒疫苗株，作為疫苗免疫，誘導免疫應答，保護雞群抵抗禽呼腸孤病毒感染，兩者的功能作用不同。因此，在本研究中，選擇禽呼腸孤病毒標準毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero細胞作為研究對象，對比和比較體外宿主細胞蛋白質的表達變化，并對差異表達蛋白質進行初步的功能探討，在體外水平上探索和闡明ARV不同毒力毒株和宿主細胞的相互作用，也為下一步開展體內研究提供試驗基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑

尿素、硫脲、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸)、ASB-14，三正丁基膦(TBP)、甘油、IPG緩沖液(pH4～7)、碘乙酰胺、考馬斯亮藍G-250、溴酚藍、標準蛋白質Marker、標準牛血清白蛋白(BSA)、雙向電泳蛋白質定量試劑盒、礦物油和IPG干膠條(pH3-10、pH4-7)均購自GE Healthcare公司，二硫蘇糖醇(DTT)、低溶點瓊脂糖、蛋白酶抑制劑雞尾酒混合液、DNase和RNaseI均購自Sigma公司。磷酸、乙醇、硫酸銨、乙酸、甲醇和鹽酸均為國產分析純。

1.2主要儀器

等電聚焦儀、Ettan IPGphor 3垂直電泳槽、Image Scanner Ⅲ LabScan 透射掃描儀、LabScan軟件、ImageMaster 2D Platinum 6.0圖像分析軟件購自GE Healthcare公司；超聲波破碎儀Vibra cellTM、紫外分光光度儀(ND-1000)購自美國Nano Drop公司；旋渦混合器WH-861、水平搖床(WD-9405B )購自北京六一儀器廠。

1.3細胞培養和病毒接種

Vero 細胞生長在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，培養在37 ℃ 5% CO2的培養箱中。培養成單層細胞后，接種104TCID50的禽呼腸孤病毒液，感染后第12、24和48 小時(hpi)收集細胞，用于蛋白質樣品的制備和后續分析。

1.4細胞蛋白質樣品的制備

將感染后的細胞和空白對照細胞分別收集，加入細胞裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，2% CHAPS，20 mmol·L-1DTT，40 mmol·L-1Tris-CL，0.8% IPG緩沖液pH 4～7，1 mmol·L-1PMSF)進行裂解，離心取上清，轉移至新的EP管中。并吸取20 μL裂解上清，測量蛋白質濃度，余下的蛋白質樣品存于-70 ℃備用。

1.5 蛋白質樣品的濃度測定和SDS-PAGE電泳

為了確保各個蛋白質樣品上樣量的一致性，在進行雙向凝膠電泳前，按照Bio-Rad公司的Quick Start Bradford蛋白質檢測試劑盒操作說明，對蛋白質樣品進行定量分析。每個標準樣品和待測樣品均做3個重復。為了進一步確定蛋白質樣品的提取完整性和上樣量，根據待測樣品的蛋白質濃度，調整各樣品的上樣體積，吸取同等量蛋白質，進行SDS-PAGE檢測。

1.6水化和等電聚焦

將水化上樣液和1 mg蛋白質樣品溶液混合，終體積為500 μL，緩慢地加入聚焦槽中，再放入24 cm pH 4～7的干膠條，使其充分地浸泡。在每條膠條上覆蓋1 mL礦物油，防止蛋白質樣品揮發。將加好樣品的聚焦槽放入等電聚焦儀中，按照表1設置程序，進行主動水化和等電聚焦。整個過程的溫度設置為20 ℃，每條膠條限流為50 μA。

表1等電聚焦程序

Table 1IPGphor running conditions

1.7平衡和聚丙烯酰胺凝膠電泳

等電聚焦結束后，將膠條從聚焦槽中取出，進行平衡(平衡緩沖液Ⅰ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2% DTT；平衡緩沖液Ⅱ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2.5% 碘乙酰胺)。再將膠條轉移到12% 聚丙烯酰胺凝膠上，進行第二向垂直電泳。電泳程序為80 V恒壓下，跑膠30 min；然后在200 V恒定電壓下，電泳約8 h。電泳結束后，進行考馬斯亮藍染色。

1.8圖像掃描和軟件分析

染色結束后，用掃描儀掃描采集圖像。按照GE公司的使用說明書，采用ImageMaster 2D Platimun Software 7.01軟件進行圖像分析。

1.9質譜鑒定

將差異表達蛋白質點從凝膠中切下，置于1.5 mL EP管中，送廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室的蛋白質組學平臺進行樣品的質譜鑒定。

1.10差異蛋白質的GO分析

利用DAVID軟件，對質譜鑒定出的差異蛋白質進行GO分析，預測和注釋其分子功能、可能參與的生物過程以及pathway，并對其進行顯著性分析，探討和分析差異蛋白質在ARV感染過程中的功能和作用。

1.11差異蛋白質的Real-time RT-PCR驗證

選擇部分差異蛋白質，根據其在GenBank上發表的基因序列，設計特異引物(表2)，建立熒光定量RT-PCR檢測方法。

2結果

2.1ARV S1133和aS1133感染Vero細胞

如圖1所示，將104TCID50ARV S1133和aS1133感染Vero細胞后，從24 hpi開始，出現細胞變圓，細胞間空隙變大，到48 hpi時，細胞變圓聚集，出現明顯病變，甚至部分細胞出現脫落，72 hpi時，細胞開始死亡，脫落。所以選取12、24和48 hpi的細胞，用于后續試驗。

表2 熒光定量PCR檢測差異表達蛋白質的引物序列

Table 2Primers used for detection of differentially expressed protein by qRT-PCR

2.2細胞蛋白質樣品的制備

ARV S1133和aS1133感染 Vero細胞后的第12、24和48 小時，收集各組細胞，抽提蛋白質，用Bradford方法檢測蛋白質樣品的質量濃度，并調整為4～5 mg·mL-1，然后進行SDS-PAGE電泳，評估蛋白質樣品的質量。若抽提的蛋白質樣品條帶完整清晰，可用于雙向凝膠電泳。

2.3雙向凝膠電泳分析

將S1133和aS1133分別感染的細胞蛋白質樣品和對照細胞蛋白質樣品，以同樣的蛋白質量上樣，進行雙向凝膠電泳分析。為了減少試驗誤差，每個樣品重復3次，采用相同的實驗條件。凝膠染色掃描獲得圖像數據后，利用ImageMaster 2D Platium Software 7.01軟件分析蛋白質點，選擇表達差異≥2.0的蛋白質點為顯著差異表達蛋白質點。結果顯示，3個感染時間點樣品中共篩選出顯著差異表達蛋白質61個(圖2)。

2.4質譜鑒定和分析

將表達差異顯著的差異蛋白質點從凝膠中切下，膠內胰酶消化，進行MALDI-TOF MS/MS+MS串聯質譜鑒定和分析，使用MASCOT搜索引擎對NCBI等數據庫進行搜索，結果成功鑒定了44 個蛋白質點，屬于33種蛋白質(表3～5)。在12 hpi時，上調表達的差異蛋白質有5個，下調蛋白質6個；24 hpi時，13個上調蛋白質，3個下調蛋白質；48 hpi時，13個上調蛋白質，4個下調蛋白質。

運用DAVID軟件進行差異表達蛋白質的GO功能分析，差異蛋白質可以分為信號轉導相關蛋白質(如heat shock protein 27，Peroxiredoxin-4，alpha-enolase)、生物代謝相關蛋白質(如thioredoxin domain-containing protein 5，hnRNP H1，hnRNP K)、生物合成轉運相關蛋白質(如protein disulfide isomerase，peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 3 isoform)、細胞骨架蛋白(如tubulin，tropomyosin alpha-3 chain isoform 3)以及未知蛋白質等(圖3)。差異表達蛋白質的GO功能分析結果說明與ARV aS1133感染相比，細胞受到ARV S1133感染后，細胞骨架蛋白、與蛋白質結合轉運折疊相關蛋白質、信號傳導相關蛋白質和生物代謝相關蛋白質的表達發生改變，引起細胞正常結構的改變甚至破壞，細胞內外的信號傳導調控、細胞蛋白質結構和功能的平衡維持被打破，最后導致細胞的生物合成和代謝也遭到破壞，這可能是由于ARV S1133和aS1133之間的毒力不同，進而對宿主細胞造成的影響也不同。

2.5熒光定量RT-PCR驗證

為了驗證雙向凝膠電泳數據的準確性，選擇4個差異表達蛋白質，以GAPDH基因作為內參基因，用熒光定量RT-PCR方法對其在12、24和48 hpi 時的基因轉錄水平進行驗證。如圖4所示，與aS1133感染的細胞相比，hnRNP和Prx-4在S1133感染細胞中轉錄水平持續上升，而Tubulin和a-enolase僅分別在48和24 h時轉錄上調，與雙向凝膠電泳的結果一致。

表3ARV S1133和aS1133感染Vero細胞后12 h的差異表達蛋白質的質譜鑒定結果

Table 3Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 12 hpi

表4ARV S1133和aS1133感染Vero細胞后24 h的差異表達蛋白質的質譜鑒定結果

Table 4Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 24 hpi

表5ARV S1133和aS1133感染Vero細胞后48 h的差異表達蛋白質的質譜鑒定結果

Table 5Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 48 hpi

3討論

在本研究中，通過雙向凝膠電泳結合質譜鑒定方法，尋找ARV強毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero細胞后不同時間點的蛋白質表達變化。結果顯示，ARV強毒株感染細胞后，相比較于弱毒疫苗株，能夠引起一些與細胞骨架、信號轉導、生物合成與代謝等相關的蛋白質表達變化，包括微管蛋白、α-烯醇化酶、過氧化物酶等。

研究表明，許多病毒在感染宿主時，能夠改變和利用細胞骨架蛋白，調控宿主生理活動過程中相關酶類蛋白質的活性和功能，以實現病毒的侵入、復制以及持續感染等[11]。X.Zheng等對傳染性法氏囊病病毒感染雞胚成纖維細胞的差異蛋白質組學進行分析，發現大量的細胞骨架蛋白質，如Tubulin、Viementin等在表達上發生顯著性變化[12]。王曉虎發現狂犬病病毒感染N2a細胞時，誘導了α-烯醇化酶的上調，加速了糖酵解途徑，減少氧化應激反應，以調節細胞生存期，維持狂犬病病毒的持續性感染[13]。此外，抗氧化物酶類蛋白質，如Peroxiredoxin-4(Prx-4)等，經研究證實是一個NF-κB信號通路和c-Jun N端激酶的硫氧還蛋白過氧化物酶相關激活劑，對清除細胞中的活性氧、細胞增殖、凋亡具有調控作用，還廣泛參與細胞信號傳導[14]。在本研究中，發現相比較于ARV S1133感染，aS1133 ARV感染細胞中這些蛋白質表達發生顯著性改變，根據參考文獻報道，推測Tubulin等細胞骨架蛋白質的表達上調可能與ARV感染宿主細胞過程中的細胞增殖、凋亡有關；hnRNP蛋白的表達上調可能與ARV感染時細胞能量代謝、核酸代謝的改變有關；α-烯醇化酶和Prx-4等蛋白質的上調表達可能與ARV感染時細胞的應答有關。這些結果也表明ARV不同毒株的毒力差異導致了感染細胞的應答結果不同，進而決定了病毒的感染進程和宿主的應答反應結果。

由于雙向凝膠電泳技術的局限性，一些相對分子質量過大、過小的蛋白質或極性蛋白質不能檢測出，并且也不能精確地定量出差異蛋白質在不同感染時間點的表達量變化，在以后試驗中考慮采用其他方法做進一步研究。

4結論

采用雙向凝膠電泳結合質譜鑒定的蛋白質組學技術，進行了禽呼腸孤病毒強毒株和弱毒疫苗感染宿主細胞后的蛋白質組學分析，獲得了44個差異表達蛋白質，為進一步理解禽呼腸孤病毒感染致病機制和宿主免疫應答機制奠定了基礎。

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(編輯白永平)

Proteomic Analysis of Vero Cells Infected by Avian Reovirus Virulent Strain and Attenuated Vaccine Strain

HUANG Li，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，FAN Qing，LUO Si-si，HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting，ZHANG Yan-fang，WANG Sheng

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology，GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

Key words:avian reovirus；virulent strain；attenuated vaccine strain；Vero cells；differentially expressed proteins

Abstract:To discover protein expression changes in infected Vero cells with avian reovirus (ARV) virulent strain S1133 and attenuated vaccine strain aS1133，respectively，two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectroscopy (MS) technologies were utilized to separate and identify the total proteins of Vero cells inoculated with ARV S1133 or aS1133 as well as control cells at desired time points post infection.The identification results showed that total 44 differently expressed protein dots were identified，including α-enolase，Prx-4，hnRNPs，tubulin，protein phosphatase，transcription elongation factor.These differentially expressed proteins were involved in various biological functions，including signaling transduction，cytoskeleton，metabolism，protein disfolding，cell proliferation and apoptosis.The results of quantitative RT-PCR validated the mRNA expression of α-enolase，Prx-4，hnRNPs and tubulin were in agreement with that of proteomic analysis.The present data highlighted protein expression differences in infected cells with ARV virulent strain and attenuated vaccine strain，which would contribute to further elucidate the interaction between ARV and hosts.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.016

收稿日期：2015-07-25

基金項目：國家自然科學基金(31160512)；廣西自然科學基金(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項(2011B020)；廣西水產畜牧獸醫局科技項目(桂漁牧科201452003)

作者簡介：黃莉(1978-)，女，廣西南寧人，博士，主要從事禽病防治與病原分子生物學研究，Tel: 0771-3120371, E-mail: lhuang405@126.com *通信作者：謝芝勛(1963-)，研究員，主要從事畜禽傳染病分子生物學研究，E-mail: xiezhixun@126.com

中圖分類號：S852.659.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0331-09