超高壓液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便中3種β-受體激動劑殘留

石　奧

(北京市畜牧業環境監測站，北京　102200)

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超高壓液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便中3種β-受體激動劑殘留

石奧*

(北京市畜牧業環境監測站，北京102200)

β-受體激動劑俗稱“瘦肉精”，可促進蛋白質的合成，加速脂肪的轉化和分解，提高動物的瘦肉率，常見的“瘦肉精”有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。盡管農業部已于1997年嚴禁將包括克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在內的β-受體激動劑作為動物促生長劑使用，但近年來持續發生瘦肉精中毒事件，例如2010年9月8日深圳商報報道深圳出現食用蛇肉瘦肉精中毒事件，2011年央視315特別行動節目曝光雙匯使用“瘦肉精”豬肉事件，2012年12月6日南方周末報道湖南出現牛肉瘦肉精超標事件等。β-受體激動劑在豬、牛以及禽類上均出現違規使用現象。人食用含β-受體激動劑的食品會出現心跳加快、心悸等癥狀，嚴重者會導致癌變。β-受體激動劑在動物體內的吸收率低，大部分以原藥形式排出體外，通過尿液和糞便進入環境，造成水體、土壤污染。

當前的研究側重于畜禽尿液中β-受體激動劑殘留對環境的影響，相對于尿液，糞便作為畜禽主要排泄物更易獲得，且穩定性及代表性更強，但相關報道較少。1996年Batjoens等[1]采用氣相色譜-質譜聯用儀檢測動物糞便中的克倫特羅，2014年李丹妮等[2]采用在線凈化液相色譜-質譜聯用儀檢測畜禽糞便中7種β-受體激動劑，側重于研究苯胺型β-受體激動劑。開展畜禽糞便中多種類型β-受體激動劑殘留檢測技術的研究，對分析其進入環境中產生的污染風險具有重要意義。目前，β-受體激動劑殘留的檢測方法有酶聯免疫法、高效液相色譜法[3]、氣相色譜-質譜聯用法[1，4-6]、液相色譜-質譜聯用法[2，7-9]。相比較而言，酶聯免疫法的誤差較大，一般只能定性；高效液相色譜法易受干擾成分影響，低含量時易出現假陽性樣品；氣相色譜-質譜聯用法準確度較高，但前處理需衍生，操作較為繁瑣，檢測結果的穩定性較差；而液相色譜-質譜聯用法的準確度高、檢出限低，基質干擾較小，選擇性強、上機檢測簡便快速，在β-受體激動劑的檢測中得到了更廣泛的應用。

本文旨在使用液相色譜-質譜聯用儀建立畜禽糞便中多種β-受體激動劑殘留的檢測方法，既能覆蓋苯胺型和苯酚型兩種類型的β-受體激動劑以提高方法的適應性，又能提高檢測效率以及獲得穩定的回收率，為β-受體激動劑在環境中的殘留分析和風險評價提供了基礎依據。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

XEVO TQ-S三重四極桿液相色譜質譜聯用儀(美國 Waters公司)；T18高速分散器(德國IKA公司)；WD-12水浴氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；FE20 pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KH-100PE數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；TDL-40B型低速離心機、GL-20B型 高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；THZ-82氣浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；LGJ-12冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；QL-861漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；負壓固相萃取裝置(天津博納艾杰爾科技有限公司)；MCX固相萃取柱(60 mg，3 mL，德國CNW公司)。

克倫特羅鹽酸鹽(CLE,C11668550)、萊克多巴胺鹽酸鹽(RAC,C16805000)、沙丁胺醇(SAL,C16903000)(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3(加拿大CDN公司)；β-葡萄糖醛苷酸酶：>100 000 units/mL(德國Merck公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；高氯酸(分析純，金鹿化工有限公司)。

1.2標準溶液的配制

準確稱取適量的克倫特羅鹽酸鹽、萊克多巴胺鹽酸鹽、沙丁胺醇、克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3標準品，用甲醇分別配制成100 μg/mL的標準貯備液，置于-18 ℃冰箱保存。準確移取各種單標貯備液，配制各種濃度的混合標準液和混合內標液，備用。

1.3樣品采集與制備

選取北京規模化豬場、雞場、牛場，采集新鮮糞便，多點采樣混合[10]，制成約500 g的代表性樣品，現場于4 ℃以下冷藏保存，盡快運回實驗室，冷凍儲存。將經冷凍干燥處理后的樣品用研缽研磨，過1 mm篩制備檢測樣品，避光保存并測定含水率。

1.4樣品前處理

準確稱取2.00 g畜禽糞便樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸鈉緩沖鹽(pH 5.2)，充分混勻，加入5 μLβ-葡萄糖醛苷酸酶，混勻，37 ℃氣浴避光振蕩水解16 h。酶解后置于室溫，加入50 μL 100 μg/L的內標混合液于待測樣品中，加蓋渦旋混勻，加高氯酸調節pH值至1.0±0.1，8 000 r/min高速離心5 min，取上清液。用10 mol/L NaOH溶液調節pH值至11.0，8 000 r/min高速離心5 min，取上清液。加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，振蕩10 min，8 000 r/min高速離心5 min，取上清液。殘液中加入10 mL乙酸乙酯再提取1次，合并上清液，50 ℃氮氣吹干，1 mL 0.1%甲酸-水定容，超聲混勻1 min，過0.22 μm微孔濾膜凈化，待測。

1.5儀器條件

1.5.1超高壓液相色譜條件采用BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流動相：乙腈(A)和0.1%甲酸-水(B)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃。梯度洗脫程序為：0 ~2 min,5%~40%A;2 ~3 min,40%~95%A;3 ~3.1 min,95%A;3.1 ~4 min,95%~5%A。

1.5.2質譜條件離子源：電噴霧離子源；電離方式：ESI；掃描方式：正離子；監測方式：多離子反應監測(MRM)；離子源溫度：150 ℃。根據歐盟指令[11]規定：為確保質譜檢測的可信度，低分辨質譜聯用檢測應選擇檢測化合物1個母離子和2個以上的子離子。在確定各物質的母離子基礎上，經Daughter-scan方式選擇子離子的質量數及最佳碰撞能量，建立MRM模式，相關質譜參數見表1。

表1　3種β-受體激動劑和相應內標物的質譜參數

*quantitative ion(定量子離子)

2結果與討論

2.1提取液的選擇

根據苯環上取代基的差異，β-受體激動劑可分為苯胺型和苯酚型。苯胺型結構中具有芳伯胺基，中等極性，如克倫特羅；苯酚型一般具有鄰(間)苯二酚或苯酚結構，由于含有胺基和酚羥基，故具有較高極性，沙丁胺醇和萊克多巴胺屬于苯酚型。苯酚型的軛合代謝過程較強，沙丁胺醇的代謝物主要以硫酸軛合物的形式存在，其次為葡萄糖醛酸軛合物，萊克多巴胺主要以葡萄糖醛酸軛合物形式存在[12]，所以，苯酚型β-受體激動劑需通過酸性水溶液水解和酶解解離，使其轉化為代謝前的化合物后再進行提取，而文獻[1-2]只針對苯胺型β-受體激動劑，無需此過程。

表2　豬糞中3種β-受體激動劑的絕對回收率

畜禽糞便樣品的成分非常復雜，特別是有機質含量特別高[13]，僅通過高氯酸水解[14]很難將樣品凈化提取，必須轉化到堿性條件下，通過有機溶劑進一步凈化提取。常用的液液萃取劑[15]有乙腈、乙醚、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等，也有采用混合溶劑萃取的研究，如乙酸乙酯-異丙醇(60∶40)[9]、乙酸乙酯-丁醇、乙醇-水[16]等。本文比較了不同提取液對畜禽糞便中β-受體激動劑殘留的提取效果，提取液包括乙腈、異丙醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-異丙醇(60∶40)。以添加絕對回收率(同等濃度，加標樣品的峰面積/溶于基質空白溶液中樣品的峰面積×100%)為指標，考察了上述5種提取液對畜禽糞便中1 μg/kg的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的提取效果，結果表明：用異丙醇、乙酸乙酯-異丙醇(60∶40)提取的樣品中雜質較多，基體干擾嚴重，克倫特羅和萊克多巴胺的回收率<10%，沙丁胺醇的回收率為0%；叔丁基甲醚提取樣品的回收率小于15%,回收率均過低；乙腈和乙酸乙酯提取的樣品雜質較少，回收率較高，分別可達到35.2%~55.3%和38.1%~52 .1%，但乙腈不易揮發，難以吹干濃縮樣品，前處理時間較長。綜合比較而言，乙酸乙酯的提取效果較好，實驗結果見表2。由表2可以看出，苯胺型β-受體激動劑的極性較弱，采用極性有機溶劑提取時，回收率較好；而苯酚型β-受體激動劑的極性較強，提取回收率差。由于樣品基質復雜，需要較為復雜的前處理凈化和降低基質干擾，導致樣品的絕對回收率較低，無法滿足外標法測定時對回收率的要求(60%~120%)，需通過內標法來降低前處理過程中樣品的損失和基質的影響。

2.2固相萃取與液液萃取的比較

基質效應是指在樣品測試過程中，待測物以外的其他物質的存在，直接或間接影響待測物響應的現象[17]。采用液質聯用方法檢測瘦肉精時，由于基質抑制效應明顯，普遍采用內標法降低基質效應的影響，適當的前處理方法也有利于降低基質效應，但前處理方法過于復雜會降低檢測效率，增加污染的風險，造成目標組分的損失，降低目標組分的回收率。本實驗以添加2 μg/kg克倫特羅的豬糞為參照，比較了液液萃取及固相萃取(樣品經MCX柱凈化)的加標回收率，兩者的相對回收率((加標樣品的峰面積/加標樣品內標物的峰面積)/(溶于空白基質溶液中樣品的峰面積/溶于空白基質溶液中內標物的峰面積)×100%)分別為95.4%和96.3%，相差不大，表明采用固相萃取后，基質效應未明顯改善。而固相萃取后的絕對回收率為32.8%，較液液萃取的絕對回收率(37.5%)有所降低，可見經過固相萃取后，待測組分有更多損失。一般質譜類實驗要求回收率在60%~120%之間，從檢測結果看，兩種處理方式的絕對回收率都無法滿足實驗要求(<60%),通過內標法定量，液液萃取和固相萃取均可滿足檢測要求(60%~120%)。而固相萃取因操作繁瑣、耗時、成本高，對檢測結果無明顯改善，所以本實驗采用液液萃取，在滿足實驗要求的同時，又可節省成本和時間。

2.3色譜條件的優化

比較了甲醇和乙腈作為流動相中的有機相時對目標物分離效果和響應值的影響。結果發現，乙腈作為有機相可獲得更好的分離效果和檢測靈敏度。在流動相的水相中加入甲酸，可增加其在ESI+模式下的離子化效率。本實驗分別配制0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%的甲酸水溶液和乙腈作為流動相，考察了甲酸濃度對待測物分離效果的影響。結果表明，加入0.1%的甲酸時能獲得最好的分離效果，同時可獲得較好的離子化效率。經過反復優化，確定了“1.5.1”所述梯度洗脫條件。圖1為優化條件下，3種化合物在多反應監測模式(MRM)下的特征離子質量色譜，可觀察到3種化合物在2 min內出峰并且分離效果理想。

表3　3種β-受體激動劑的線性方程、相關系數及檢出限

2.4線性范圍與檢出限

用基質溶液配制質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/L的系列標準溶液，加入50 μL 100 μg/L的內標混合液，定容至1.0 mL，上機測定。以濃度(X，μg/L)為橫坐標，分析物峰面積與內標物峰面積的比值(Y)為縱坐標繪制標準曲線。3種β-受體激動劑在0.5 ~20.0 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.998。采用空白樣品添加3種β-受體激動劑的方法，根據信噪比S/N≥3確定方法檢出限(LOD)，得到畜禽糞便樣品中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅的檢出限分別為0.04，0.06，0.07 μg/kg(表3)。β-受體激動劑作為我國明令禁用的獸藥，中國人民共和國農業部第235號公告[18]中規定在所有食品中不得檢出，因此在實際檢測中對檢出限要求較高，參考農業部1025號公告-18-2008[19]的檢出限(0.25 μg/kg)，本方法的檢出限均低于0.25 μg/kg，滿足畜禽糞便中β-受體激動劑的檢測要求。

2.5回收率與精密度

準確稱取豬糞、牛糞、雞糞陰性樣品進行加標回收率與精密度實驗，加標水平為1，2，5 ng，每個水平做3個平行，結果見表4。結果表明，3種β-受體激動劑的平均回收率為80.3%~110.2%，相對標準偏差(RSD)為3.0%~7.7%。可見本方法的準確度和精密度均可滿足畜禽糞便中瘦肉精殘留的檢測要求。

2.6實際樣品的分析

在北京郊區采集16家規模化畜禽養殖場的畜禽糞便樣品，其中豬場8家、雞場5家、牛場3家。

表4　3種β-受體激動劑的平均回收率與相對標準偏差(n=3)

采用本方法對所采集樣品進行測試，每個樣品做2個平行，結果所有樣品中均未檢出克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺。

3結論

本文建立了超高壓液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定畜禽糞便中3種β-受體激動劑殘留的檢測方法。采用液液萃取的前處理方法，省去了固相萃取凈化樣品的步驟，節省了時間，降低了成本。通過內標物的使用彌補了基體抑制效應和前處理過程中被測物損失對定量結果的影響，該方法靈敏度高，適用范圍廣，具有較好的穩定性，適用于各類畜禽糞便中β-受體激動劑殘留的檢測。

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摘要：建立了畜禽糞便中3種β-受體激動劑藥物殘留的超高壓液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀測定方法。樣品酶解后經高氯酸溶液凈化，調節pH值至堿性，乙酸乙酯提取，凈化濃縮后以流動相定容，用超高壓液相色譜-質譜聯用儀檢測，內標法定量。3種β-受體激動劑在0.5 ~20.0 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.998。畜禽糞便中3種β-受體激動劑的加標回收率為80.3%~110.2%，相對標準偏差為3.0%~7.7%，檢出限(S/N=3)為0.04 ~0.07 μg/kg。

關鍵詞：超高壓液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀;畜禽糞便;β-受體激動劑;內標法

Determination of 3β-Agonists in Animal Manure by Ultra High Performance Liquid Chromatography and Mass SpectrometrySHI Ao*

(Beijing Monitoring Station for Animal Husbandry Environment,Beijing102200,China)

Abstract：A method for the simultaneous determination of 3 β-agonists in animal manure was studied by ultra high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometry(UPLC-ESI MS/MS).The drugs were cleaned up with perchloric acid solution after enzymolysis and adjusting pH to alkaline.The purified analyte was extracted with ethyl acetate.The extract was evaporated to dryness under nitrogen,and reconstituted in mobile phase solution.The target compounds were confirmed and quantified by UPLC-ESI MS/MS with the internal standard method.Under the optimal conditions,the calibration curves of 3 β-agonists showed good linearities in the range of 0.5-20.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.998.The average recoveries of 3 β-agonists were in the range of 80.3%-110.2%,and the relative standard deviations(RSDs) were 3.0%-7.7%.The limits of detection(S/N=3) ranged from 0.04 μg/kg to 0.07 μg/kg.

Key words：ultra high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometry(UPLC-ESI MS/MS);animal manure;β-agonists;internal standard method

中圖分類號：O657.63

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0074-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.012

通訊作者：*石奧，碩士，研究方向：畜禽養殖產地環境，Tel:010-28348303，E-mail:stoneao12@sohu.com

基金項目：北京市農委 (PXM2014 036240 000012)

收稿日期：2015-07-08；修回日期：2015-08-07