同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜法測定水果及其制品中的展青霉素

項瑜芝，許嬌嬌，蔡增軒，莫衛民，任一平,*

(1.浙江工業大學　化學工程學院，浙江　杭州　310014；2.浙江省疾病預防與控制中心，浙江　杭州　310051)

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同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜法測定水果及其制品中的展青霉素

項瑜芝1，許嬌嬌2，蔡增軒2，莫衛民1，任一平1,2*

(1.浙江工業大學化學工程學院，浙江杭州310014；2.浙江省疾病預防與控制中心，浙江杭州310051)

摘要：建立了同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜法對水果及其制品中的展青霉素進行測定。澄清果汁(濁汁、固液體及固體樣品需用果膠酶酶解處理，乙酸乙酯提取濃縮后復溶)經混合型陰離子交換柱凈化、富集后，采用Waters HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)以乙腈-水為流動相梯度洗脫，電噴霧離子源離子化，負離子多反應離子監測(MRM)模式檢測，同位素稀釋內標法定量。展青霉素在5~250 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)大于0.999，該方法在不同基質不同加標濃度下，回收率為90.6%~110.1%，相對標準偏差(RSD)為1.4%~3.9%，定量下限為5.0 μg/kg(蘋果汁中定量下限為2.0 μg/kg)。該方法準確可靠、靈敏度高，適合于水果及其制品中展青霉素的測定，可滿足我國GB 2761-2011對于水果制品、果蔬汁和酒類(僅限蘋果和山楂)中展青霉素殘留的檢測要求。

關鍵詞：展青霉素；高效液相色譜-串聯質譜法；同位素稀釋法；水果及其制品

展青霉素(Patulin)是由曲霉和青霉等真菌產生的一種次級代謝產物[1]，主要污染水果及其制品，尤其是蘋果、山楂、番茄和山楂片等[2-4]。該物質有影響生育、致癌和免疫抑制等毒理作用，同時也是一種神經毒素，可對呼吸和泌尿等系統造成損害[5]。我國食品安全國家標準《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》已明確規定食品中水果制品(果丹皮除外)、果蔬汁類及酒類(僅限蘋果和山楂)中展青霉素的限量值為50 μg/kg。

目前測定展青霉素的常用方法有薄層色譜法[6]、液相色譜法[7-10]、氣相色譜-串聯質譜法[11-12]及液相色譜-串聯質譜法[13-18]等。我國現有的國家標準采用薄層色譜法，該方法存在酚類成分干擾嚴重、難分離等問題，只能用于半定量檢測。液相色譜法是目前普遍使用的方法之一，結合液液萃取凈化法[7-8]、固相萃取法[9-10]等前處理手段，可提高檢測靈敏度和準確性，但在實際樣品的檢測中仍存在假陽性和雜峰干擾的問題。高效液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、準確性強的特點，牛華等[13]建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯三重四極桿質譜(UPLC-ESI-MS/MS) 聯用技術分析果汁中展青霉素的方法，該方法以Oasis HLB固相萃取柱(SPE)凈化，C18色譜柱為分離柱，水-乙腈溶液作為流動相進行梯度洗脫，電噴霧離子源電離、負離子多反應監測模式質譜進行定性和定量分析，測得果汁等樣品的定量下限為5 μg/kg。液相色譜-質譜法大多僅針對基質效應較小的果汁樣品，鮮有針對山楂及其制品這類基質效應嚴重、有雜峰干擾的復雜基質的研究，尤其是難制樣的果丹皮。同位素稀釋內標法既可克服基質效應帶來的誤差，又可校正實驗過程的損失，可獲得高準確度和高精確度。

本文對比現有的液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法，優化前處理條件，評價基質效應，并針對GB 2761-2011的檢測對象建立了準確可靠、靈敏度高的同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜分析方法。該方法滿足蘋果、山楂等水果及其制品中展青霉素的測定要求，克服了原國標檢測方法出現假陽性檢測結果時缺乏確證方法的現況，為現有國家食品安全檢測方法的修訂提供了技術支持。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(LC MS-8050，島津公司)；固相萃取裝置(美國Waters公司)；旋轉蒸發儀(Buchi B-490型，瑞士Buchi公司)；高速離心機(AllgraTM64R型，美國Beckman公司)；超純水機(Millipore System型，美國Millpore公司)。

展青霉素標準物質(含量>98%，ALEXIS Biochemicals)，展青霉素同位素標準物質13C7-Patulin(含量>98%，美國Romer公司)；乙腈、甲醇、乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；乙酸銨、碳酸鈉(分析純，上海試劑有限公司)；果膠酶(美國Sigma公司)；實驗用水為超純水。

1.2標準溶液配制

稱取1.0 mg展青霉素標準品用0.2%乙酸水溶液溶解轉移至10 mL容量瓶中，定容得展青霉素濃度為100 μg/mL的標準溶液。準確吸取100 μL的100 μg/mL展青霉素標準溶液至10 mL容量瓶中，用pH 4.0的乙酸水溶液定容，得濃度為1 μg/mL的展青霉素工作液。準確移取0.40 mL展青霉素同位素內標(25 μg/mL)至10 mL容量瓶中，用pH 4.0的乙酸水溶液定容，得濃度為1 μg/mL的同位素內標工作液(13C7-展青霉素)。

1.3樣品制備

液體樣品(蘋果汁、山楂汁等)：將所有液體倒入勻漿機中，混勻后密封。酒類試樣需超聲脫氣1 h或4 ℃低溫條件下存放過夜脫氣。

固體樣品(山楂片等)：用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后密封。果丹皮經液氮凍干后立刻用高速粉碎機將其粉碎，混合均勻后密封。

1.4樣品前處理

1.4.1酶解與提取對于固體樣品，稱取1 g試樣于離心管中，加入50 ng同位素內標，再加入10 mL水與75 μL果膠酶溶液混勻，室溫下避光放置過夜，振蕩后加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混合5 min，于6 000 r/min 下離心5 min，取乙酸乙酯層于濃縮瓶中，再用10 mL乙酸乙酯提取水相1次，合并兩次乙酸乙酯提取液，在40 ℃水浴中用旋轉蒸發儀濃縮至干，以5.0 mL pH 4.0的乙酸水溶液溶解殘留物，待凈化。

對于渾濁果汁樣品，準確量取2 mL試樣于離心管中，加入50 ng同位素內標，再加入75 μL果膠酶溶液，混勻，室溫下避光放置過夜后，在6 000 r/min 下離心5 min，取上清液過玻璃纖維濾紙，準確吸取2.0 mL待凈化。

對于澄清果汁樣品，準確量取2 mL試樣，加入50 ng 同位素內標，混勻后待凈化。

對于蘋果酒(脫氣)樣品，準確量取1 mL試樣，加入50 ng 同位素內標，混勻后待凈化。

1.4.2凈化Oasis MAX固相萃取柱分別加入3 mL甲醇和3 mL水淋洗活化，保持柱體積濕潤。將上樣液轉移至活化好的固相萃取柱中，控制樣液以2~3 mL/min的速度穩定下滴。上樣完畢后，依次加入3 mL 5 mmol/L乙酸銨溶液、1 mL水淋洗。抽干混合型陰離子交換柱，加入2 mL甲醇洗脫，控制流速為2~3 mL/min，抽干，收集洗脫液。在洗脫液中加入10 μL乙酸，40 ℃下用氮氣緩緩吹至近干，用pH 4.0的乙酸水溶液定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

1.5儀器條件

色譜條件：液相色譜柱(Waters HSS T3，100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動相：A為水，B為乙腈，梯度洗脫程序為：0~7 min，5%B；7~7.5 min，5%~100%B；7.5~9.5 min，100%B；9.5~10 min，100%~5%B；10~15 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：離子源為ESI負離子模式；檢測方式：多反應監測(MRM)；噴霧電壓：-4 000 V；氣簾氣流量：3 L/min；干燥氣流量：10 L/min；離子源加熱溫度：300 ℃。展青霉素及其同位素優化后的質譜檢測參數見表1。

表1　展青霉素及其同位素的質譜檢測參數

* quantitative ion

2結果與討論

2.1前處理條件的優化

水果及其制品中基本都含有親水有機酸及天然染料。選用固相萃取柱為凈化手段時，常用弱堿性的淋洗液(如碳酸氫鈉溶液、碳酸鈉溶液、氨水溶液)以取得較好的除雜效果。但展青霉素是親水化合物，在反相固相萃取柱中的保留較弱，因此樣品的加標回收率較差(見表2)。本文選用混合型陰離子交換柱Oasis MAX為凈化柱，強酸性雜質可被填料吸附，起到吸附除雜的作用，對以上弱堿性的淋洗液及中性淋洗液(如乙酸銨)的淋洗條件進行優化。結果表明，乙酸銨溶液作為淋洗劑時的實驗結果最佳，加標回收率大于85%。因而選擇乙酸銨溶液作為淋洗液。

表2　以Oasis MAX柱為凈化柱時不同淋洗液對展青霉素凈化效果的影響(n=3)

測定果汁中展青霉素時常用的固相萃取柱有Oasis HLB柱[13]與分子印跡親和柱[19]。分別考察了Oasis HLB柱、分子印跡親和柱以及混合型陰離子交換柱對蘋果汁樣品的凈化效果。從表3可以看出，分子印跡親和柱的回收率波動較大，原因在于實驗過程必須保持柱體濕潤，否則會影響分子印跡聚合物與展青霉素的有效結合，進而影響回收率，不適宜批量實驗，且價格昂貴。相比之下，混合型陰離子交換柱Oasis MAX的準確度和穩定性更佳，適用于果汁中展青霉素的測定。

表3　展青霉素在不同固相萃取柱中的回收率(n=6)

表4　不同樣品的基質效應評價(n=3)

*IS-normalized MF=(Patulin MF)/(13C7-Patulin MF),**CV=

RSD{IS-normalized MF}

2.2基質效應評價與同位素內標稀釋法定量的選擇

2.2.1基質效應評價液相色譜-質譜法基于目標分析物離子化并用特定的子離子核質比來進行定量分析，在實際樣品測定時，有些雜質會因干擾待測物的離子化而影響其離子化效率，產生基質效應。因此本實驗采用同位素稀釋內標法定量以消除或降低基質效應。選取蘋果汁、山楂片和蘋果酒為考察基質，以50 μg/kg的同位素13C7-展青霉素和5 μg/kg的展青霉素為檢測點，采用樣品提取后加入法來評價基質效應[20]，即樣品經試驗凈化后在定溶液中加入展青霉素及其同位素。其中，展青霉素的基質效應因子(Matrix factor，MF)是其在基質中與在溶劑中的響應峰峰面積的比值，展青霉素同位素的基質效應因子是其同位素在基質中與在溶劑中的響應峰峰面積的比值。內標歸一化基質效應因子(IS-normalized MF)是展青霉素的基質效應因子與其同位素的基質效應因子的比值，因為展青霉素及其同位素的絕對基質效應相近，可用兩者基質效應的比值來抵消展青霉素的基質效應。內標歸一化基質效應因子的變異系數(CV)[21]是不同樣品中內標歸一化基質效應因子的相對標準偏差，用于評價在不同樣品中采用同位素內標校正基質效應的準確性，CV值越小說明不同基質對結果準確度影響較小，方法越可靠。從表4可看出，CV為4.7%，小于15%，符合EMEA指導原則[21]的規定，因此該方法適合蘋果汁、山楂片和蘋果酒等不同樣品的檢測，其基質干擾可用同位素內標來校正。

2.2.2樣品基質外標法與同位素內標稀釋法定量的比較選取3種陰性基質(蘋果汁、山楂片和蘋果酒)進行加標實驗(50 μg/kg)，重復測定6次，采用外標法和同位素內標稀釋法分別定量，結果見圖1。結果表明，采用同位素內標稀釋法能達到更好的回收率和穩定性，定量更為準確。

2.3液相色譜法與液相色譜-串聯質譜法的比較

參考SN/T 2008-2007進出口果汁中棒曲霉毒素的檢測方法[22]——高效液相色譜法，采用傳統液液萃取法為凈化手段，液相色譜儀配紫外或二極管陣列檢測器進行測定。NY/T 1650-2008蘋果和山楂制品中展青霉素的測定[23]采用高效液相色譜法，MycoSep 228 AflaPat多功能柱凈化，液相色譜儀配紫外或二極管陣列檢測器測定。以上兩種液相色譜法均能對蘋果汁中展青霉素進行定量測定，但展青霉素出峰附近有較高的雜峰5-羥甲糠醛，對低濃度展青霉素的測定有影響，其定量下限為10 μg/kg。由于山楂制品含有較多糖分雜質，經以上前處理方法凈化后仍有較多雜質對展青霉素定性產生干擾，因此現有的液相色譜法不適于山楂制品中展青霉素的測定。

液相色譜-串聯質譜法的選擇性較好、適用范圍較廣。將SN/T 2534-2010(MycoSep 228 AflaPat多功能柱凈化法)[24]與本實驗建立的方法進行比較，兩者均能對蘋果和山楂制品中展青霉素進行測定，但以多功能柱為凈化手段的方法基質效應較為嚴重，山楂制品測定中存在雜質過載問題，且無對果丹皮的檢測方法。以混合型陰離子交換柱為前處理方法，在果丹皮樣品中添加展青霉素標準品進行實驗得到的定量離子色譜圖見圖2。較之現有的液相色譜法與液相色譜-串聯質譜法，本方法有著較好的靈敏度，無雜峰干擾，且適用范圍較廣，滿足GB/T 2761-2011中展青霉素污染對象的檢測要求。

2.4液相色譜-串聯質譜方法學驗證

2.4.1標準曲線與線性范圍將展青霉素標準儲備液用pH 4.0乙酸水溶液稀釋成8個不同濃度的溶液(5,10,25,50,100,150,200,250 ng/mL)，連續3 d重復實驗，其中同位素內標濃度為50.0 ng/mL，以質量濃度(X，ng/mL)對展青霉素與其同位素定量離子的峰面積比值(Y)建立標準曲線。3 d的回歸方程依次為Y=3.020 3X+0.047 2，Y=2.992 6X+0.071 7及Y=3.048 4X+0.070 3，相關系數(r2)均在0.999以上，方法的線性關系良好。

2.4.2檢出限與定量下限選取4種陰性樣品(蘋果汁、山楂片及蘋果酒)，加入展青霉素標準溶液(加標水平為5 μg/kg)，按照本方法進行前處理，分離檢測，重復實驗20次。得出3種實際樣品在5 μg/kg加標水平下的信噪比(S/N，見表5)，以S/N=10計算定量下限，S/N=3計算檢出限。該方法在蘋果汁中的檢出限為0.5 μg/kg，定量下限為2.0 μg/kg；在山楂片和蘋果酒中的檢出限為2.0 μg/kg，定量下限為5.0 μg/kg。該定量下限彌補了液相色譜法在分析山楂等復雜基質時，由于雜質干擾，定量下限(5.0 μg/kg)不能達到低于限量值(50 μg/kg)10倍要求的缺點。

表5　不同空白基質在低濃度加標下的結果(n=20)

2.4.3準確度與精密度稱取陰性樣品(蘋果汁、山楂片及蘋果酒)，添加3個濃度(25，50，100 μg/kg)水平的標準溶液，每個濃度水平平行6次實驗，連續3 d，數據見表6。實際樣品在不同加標水平下的回收率為90.6%~110.1%，相對標準偏差(RSD)均小于5%。說明該方法對不同樣品、不同含量的展青霉素測定均有較好的準確度和精密度。

表6　不同樣品中展青霉素的加標回收率及相對標準偏差(n=6)

2.4.4有證樣品與實際樣品的測定將購自Sigma公司的有證樣品蘋果果泥，按照本方法平行6次實驗，連續3 d重復測定，測得展青霉素含量的均值為17.7 μg/kg，RSD為6.4%。與證書上展青霉素含量的理想范圍10.4~26.8 μg/kg進行比較，在合理的范圍內。說明該測定方法較準確。

對本地超市和網購的水果及其制品，包括蘋果汁、蘋果醋、蘋果醬、山楂片、山楂制品、山楂干、果蔬粉等30種樣品進行測定，在山楂片、果丹皮、山楂干中檢測到展青霉素，含量分別為2.2，4.2，24.2 μg/kg(圖3)，其余樣品均未檢出。

3結論

本文針對水果制品、果蔬汁和酒類(僅限蘋果和山楂)等不同種類樣品，建立了較全面的檢測水果及其制品中展青霉素的高效液相色譜-串聯質譜方法，并采用同位素內標法定量，克服了基質效應帶來的誤差和校正實驗過程損失。本方法的定量下限為5.0 μg/kg(蘋果汁的定量下限達到2.0 μg/kg)，有較優的靈敏度。有證樣品驗證結果表明該方法準確可靠，并已成功地對蘋果汁、蘋果醬、山楂片、果丹皮等30種實際樣品進行了檢測。方法能夠滿足我國GB2761-2011對于水果制品、果蔬汁和酒類(僅限蘋果和山楂)中展青霉素限量的檢測要求，為在現國標中增加展青霉素的液質檢測方法提供了參考依據。

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研究簡報

Determination of Patulin in Fruit Products by Isotope Dilution Combined with High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryXIANG Yu-zhi1,XU Jiao-jiao2,CAI Zeng-xuan2,MO Wei-min1,REN Yi-ping1,2*

(1.College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310014,China;2.Zhejiang

Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou310051,China)

Abstract：A method was developed for the determination of patulin in fruit products by isotope dilution with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The clear juice was directly purified and enriched with ProElut PXA.Besides,the cloud juice,solid liquid and solid samples were primarily hydrolyzed with pectinase,then extracted with ethyl acetate and concentrated,redissolved with acetic acid solution(pH 4.0),and purified and enriched with ProElut PXA.The chromatographic separation was performed on a Waters HSS T3 column(2.1 mm×100 mm，1.8 μm) by gradient elution with acetonitrile-water as mobile phase.The patulin was detected by MS with electrospray negative ionization(ESI) under multiple reaction monitoring(MRM) mode.Accurate determination was achieved using isotope as the internal standard.Results showed that the calibration curve of patulin was linear in the range of 5-250 ng/mL with correlation coefficients greater than 0.999.The limits of quantitation(LOQ) of this method were 2.0 μg/kg for apple juice and 5.0 μg/kg for apple wine and haw.The recoveries of patulin at low,medium and high spiked concentration levels were in the range of 90.6%-110.1% with relative standard deviations of 1.4%-3.9%.The proposed method was proved to be a practical method which could completely satisfy the standard requirement GB 2761-2011 for detection of patulin in fruit products including apple juice,apple wine and haw products.In conclusion,this method was reliable,accurate and sensitive,and could be used for the analysis of patulin in fruit products.

Key words：patulin;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);isotope dilution;fruit products

中圖分類號：O657.63；S852.44

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0054-07

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.009

通訊作者：*任一平，教授級高級工程師，研究方向：衛生理化檢驗及食品安全檢測技術，Tel：0571-87115261，E-mail：renyiping@263.net

收稿日期：2015-07-21；修回日期：2015-08-15