女性生育力保存新進展*

李尚為

(四川大學華西第二醫院生殖醫學中心，四川 成都 610041)

·專家述評·

女性生育力保存新進展*

李尚為

(四川大學華西第二醫院生殖醫學中心，四川 成都 610041)

【摘要】目的女性生育力整體呈下降趨勢，在影響了女性生殖健康的同時，也嚴重影響了生活質量。生殖健康和生育力保存日漸成為社會關注的焦點。生育力保存手術日漸被婦科腫瘤患者接受，胚胎冷凍、卵母細胞冷凍和卵巢組織冷凍方法的不斷改善為生育力保存提供了可行的方法。未成熟卵母細胞體外成熟、卵巢體外激活技術及干細胞技術的探索為生育力保存提供了更寬廣的思路。本文將從女性生育力的影響因素、生育力保存技術的適應征及其生育力保存的主要方法與進展作一述評。

【關鍵詞】生育力保存；女性；生育力保存手術；深低溫保存；述評

女性生育力是指女性能夠產生卵母細胞、受精并孕育胎兒的能力。通常包括:生育質量、妊娠或再次妊娠稱之為母親的潛力[1]。生育力保存(fertility preservation)是指使用手術、藥物或實驗室技術對存在不育風險的各年齡段女性提供幫助，保護和保存其產生遺傳學后代的能力[2]。

社會的不斷發展帶給人類巨大物質和精神財富的同時，環境污染、社會壓力等綜合因素也影響了人們的生育能力。世界衛生組織在25 個國家的33個研究中心的調查結果表明，發達國家不孕癥的患病率約為5% ～ 8%，發展中國家一些地區可高達30%[1]。不孕癥已經成為發病率最高的三大疾病之一。女性生育力存在個體差異，易受眾多因素影響，女性生育力的改變影響了女性生殖健康的同時，也嚴重影響了生活質量。生殖健康和生育力保存日漸成為社會關注的焦點。本文將從女性生育力的影響因素、生育力保存技術的適應癥和生育力保存的主要方法三個方面做一評述。

1女性生育力的影響因素

1.1生理因素女性年齡增加導致生育力下降的主要原因是卵巢儲備功能降低，卵巢內存留的可募集卵泡數目減少及卵子質量下降。

1.2病理因素卵巢早衰(POF，premature ovarian failure)是常見的嚴重影響女性生育力的病理因素，患病率高達1%[3]，可能與遺傳、自身免疫性異常、卵巢破壞等多種因素相關。①遺傳因素：決定卵巢功能的基因位點為Xq21.3-q27 或Xq26.1-q27和Xq13. 3-q21.1，此區域的缺失可能減少原始卵泡數、增加凋亡或卵泡成熟障礙導致的閉鎖，如Turner綜合征。大多數Turner綜合征病人在出生時生殖細胞已喪失, 但是也有部分病人是XO/XX嵌合體, 晚期才出現卵巢功能早衰[4]。 ②免疫學因素: POF 患者及自然絕經后婦女體內CD8+、CD16+T 淋巴細胞數量明顯升高，CD4+/CD8+明顯降低，可能影響淋巴細胞的調節功能，引起POF。③卵巢破壞因素:包括子宮內膜異位癥、盆腔感染因素、放化療史、盆腔手術史等。子宮內膜異位癥可從盆腔解剖結構、卵巢功能和卵子質量、腹腔免疫環境改變、子宮內膜容受性降低等多個方面影響育齡期女性的生育能力。值得注意的是，腹腔鏡雙極電凝術產生的熱能可損傷卵巢基質血管和卵巢髓質組織，導致卵巢儲備功能降低更顯著。化療后癌癥病人, 尤其是采用烷基化藥物, 卵巢早衰的風險增加9倍, 其中21～25歲女性病人卵巢早衰風險高達約27倍, 兒童病人化療后卵巢早衰發生率高達60%[5]。盆腔放射治療過程中，20Gy輻射就可導致40歲以下病人卵巢功衰竭[6]。化療、全身放療聯合骨髓移植治療, 卵巢毒副作用更明顯, 80%的兒童病人面臨卵巢功能早衰[7]。

1.3環境因素包括生活方式相關危險因素、職業相關危險因素和內分泌因素。職業相關危險因素常見:麻醉性氣體、抗腫瘤藥物、重金屬和溶劑等。內分泌因素是指外源性的化學物質和混合物干擾內分泌系統功能。

1.4社會因素因個人、職業或經濟等社會因素推遲生育計劃的女性越來越多[8]。另一方面，由于各種外界因素的影響，很多女性懷孕后會選擇人工流產，甚至多次人工流產，如人工流產后處理不當，患各種疾病，從而導致不懷孕。基于人口普查和近年國家統計局數據，使用人口預測模型得出：“全面二孩”每年帶來的新增人口在300萬～800萬之間，估計中值為500萬。夫婦中60%是35歲以上的育齡婦女，生育難度增大。另外，人口學數據顯示，1975年到2010年中國產生2.18億獨生子女，每年新增約7.6萬個失獨家庭。截至2012年，我國已有100多萬個失獨家庭，未來將達到一千萬。失獨家庭夫婦較多已達到高齡，錯過再生育的最佳時期。

1.5其他因素不良生活方式和過大心理壓力均會對生育力產生影響。不良生活方式包括: 吸煙、飲酒、長期服用咖啡因、不規律飲食、營養不良或營養過剩。自然懷孕或助孕過程中，精神緊張、焦慮、沮喪等不良情緒也常影響女性生育力。生活方式或心理因素的單個因素在不同程度上影響女性生育力，如果兩種或多種疊加，會加重對生育力的危害。

2生育力保存的適應征

2.1癌癥病人青春期前及生育期女性發病率最高的惡性腫瘤主要包括：乳腺癌，宮頸癌，腦腫瘤，腎癌，骨肉瘤，白血病、淋巴瘤及其他血液系統惡性疾病[9,10]。放療、化療和盆腔手術治療都可能對卵巢功能造成不可逆轉的損害，降低或損失生育力。隨著癌癥早期診斷率的提高、新型化療藥的出現和放化療方案的改進, 兒童、年輕女性癌癥患者生存率明顯提高。大劑量放、化療及骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT) 可使超過90%年輕女性惡性腫瘤患者病情得到緩解[11]，但卵巢功能受到明顯影響, 約80%的病人面臨卵巢功能早衰[7]。

2.2自體免疫性或血液系統疾病的病人自身免疫性或血液系統疾病的病人, 接受大劑量化療/放療后, 有卵巢功能衰竭的風險。

2.3婦科手術病人卵巢部位手術可引起卵巢儲備功能下降，如卵巢囊腫剝除術、子宮內膜異位癥的保守性或半根治性手術、子宮切除術、根治性輸卵管切除術等。另外，腹腔鏡雙極電凝術可能對卵巢造成熱損傷，引起卵巢功能下降。

2.4卵巢功能早衰病人

2.5要求推遲生育的病人

2.6不孕癥病人不孕癥病人移植新鮮胚胎后剩余胚胎可以凍存, 以備再次移植。

3女性生育力保存技術的主要方法

3.1手術治療卵巢移位：腫瘤患者在接受盆腔放療時，可將卵巢固定到盡量遠離盆腔的位置， 而不改變其與輸卵管的解剖關系。然而，由于輻射具有分散性，卵巢移位有一定的風險性，卵巢并非總能得到保護，因此卵巢移位實施時間應盡量接近開始放療的時間，以縮短移位時間[10]。生育力保存手術(Fertility-sparing surgey，FSS)[12]。①宮頸癌：為保存年輕女性生育力，Ⅰa2 ～Ⅰb 期宮頸癌患者可行根治性宮頸切除術，術式包括經陰道、開腹、腹腔鏡和機器人宮頸切除術[10]。經陰道宮頸切除術僅適用于腫物直徑<2cm患者，因為當腫物直徑>2cm時，陰式手術切除范圍局限，復發率顯著增高。其他三種術式可在必要時擴大宮旁組織的切除范圍，因此可適用于腫物直徑>2且<4cm的患者[13]。②子宮內膜癌：浸潤深度局限于子宮內膜，病理分型為高分化腺癌的子宮內膜癌患者可選擇口服孕激素來暫時保存生育力。由于子宮內膜癌高復發率的特點，當患者完成生育計劃后，應手術治療。文獻報道早期子宮內膜癌患者經孕激素治療后成功妊娠，但是孕激素治療的最佳劑量和治療方案尚需進一步明確。另外，該治療在高期別和復發率較高子宮內膜癌患者中的安全性也需進一步證實。③卵巢癌：交界性卵巢癌和惡性卵巢干細胞腫瘤患者可考慮生育力保存手術。但在侵襲性卵巢上皮癌患者中，生育力保存手術的應用晚于交界性卵巢癌和惡性卵巢干細胞腫瘤。目前尚缺乏前瞻性實驗來評估生育力保存手術在侵襲性卵巢上皮癌患者中的作用，但就目前的證據來看，FSS在部分年輕的卵巢上皮癌患者中是安全的，適用于病理分型不明確的IA-IC1-2期患者和病理分型明確的IA期患者。最新報道指出，對于高期別的交界性卵巢癌患者，FSS與腫瘤復發無明確關系[14],對于高風險的卵巢癌患者不應該完全否定FSS[15]。

3.2輔助生殖技術

3.2.1胚胎冷凍技術目前胚胎冷凍技術較成熟，卵裂球期或囊胚期的胚胎對冷凍較穩定，玻璃化冷凍胚胎復蘇率已達到90% 以上[16]，是目前惟一被北美生殖醫學委員會認可的臨床可開展的生殖力保存方法，能有效減少患者反復接受激素刺激促排卵治療。研究表明，凍融周期與新鮮周期胚胎相比，妊娠率顯著提高[17]。凍融胚胎與新鮮胚胎移植后單胎妊娠患者產前出血、早產、低體重兒和圍產期死亡率風險均降低，差異有統計學意義，提示凍融胚胎移植后圍產期不良事件發生率顯著低于新鮮胚胎移植[18]。該技術僅適用于已結婚的女性，而且需要對卵巢進行藥物刺激以獲得多個卵母細胞進行受精。卵巢刺激過程中的高雌激素治療方法對激素依賴性腫瘤，例如乳腺癌、子宮內膜癌等有不利的影響，無法很好的保證其安全性[16]。另外，獲取卵母細胞進行體外受精之前，促排卵需要2 ～ 5 周的時間，因此該技術也不適用于開始化療或惡性程度高的腫瘤患者[19]。

3.2.2卵母細胞冷凍包括未成熟卵母細胞(GV或MⅠ期)或成熟卵母細胞(MⅡ期)的冷凍。將卵母細胞冷凍保存，在需要時解凍并通過體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization - embryo transfer， IVF-ET)技術受精獲得胚胎，在女性生育力的保存方面有廣闊的應用前景[19，20]。對于成熟卵母細胞的冷凍，玻璃化冷凍方法凍存的卵母細胞存活率優于慢速程序化冷凍方法，是凍存卵母細胞非常有效的方法[21]。隨著卵母細胞冷凍技術及胞漿內單精子顯微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI) 技術的逐步成熟，冷凍卵母細胞的復蘇率、受精率、臨床妊娠率都有了明顯提高[22,23]。成熟卵母細胞(MⅡ)解凍后經受精形成胚胎，單胚胎移植后妊娠率32%～65%，活產率>50%，出生嬰兒的先天性異常率與自然妊娠相似[19]。

未成熟卵母細胞的冷凍主要針對卵巢不能刺激和不能推遲治療的癌癥患者，可從卵泡期、黃體期以及卵巢組織中收集，但是總體妊振率是很低的[24], 低體外成熟率和受精率仍是未成熟卵母細胞冷凍的瓶頸。另外關于GV 是在培養成熟后冷凍還是冷凍后再培養的問題，目前普遍傾向于未成熟卵母細胞先體外培養成熟后冷凍[24]。主要應用于以下幾方面:接受腫瘤放、化療而損傷卵巢功能患者;遺傳性疾病( 如BRCA突變)需要預防性切除輸卵管、卵巢及卵巢早衰;體外受精取卵日取精失敗;因某些原因不能凍存胚胎;希望延遲生育年齡;建立卵子庫;調配供卵與受孕最佳時機之間的時間[19]。

3.2.3卵巢組織冷凍癌癥病人因治療時間緊迫或禁忌癥等原因不能接受超排卵而凍卵或凍胚, 可采選擇凍存卵巢組織方法保存生育力。凍存卵巢組織則可以通過自體原位或異位移植, 恢復病人內分泌功能和/或排卵功能。卵巢組織凍存與再植技術具有廣闊前景，不需要激素刺激卵巢組織，對于青少年及兒童惡性腫瘤生存者是保留生育力的唯一方法，有充足的證據支持卵巢組織冷凍和再移植技術，不應該局限于實驗階段[25]。

關于卵巢組織冷凍方法，程序化冷凍的優點是使用低濃度冷凍保護劑，缺點為可誘導細胞內冰晶形成。玻璃化冷凍是快速冷凍方法，需要高濃度的冷凍保護劑，具有化學毒性和滲透性損傷，降溫快減少了冰晶形成對卵子的損傷[19]。目前全球共有超過40名新生兒通過程序化冷凍法凍存卵巢技術出生[10]，通過玻璃化冷凍法凍存卵巢技術出生的新生兒據報道僅有一名[26]。玻璃化冷凍原理是為防止細胞外冰晶形成而減少對細胞的損害，與程序化冷凍相比，可更好地保存卵泡和基質結構，提高卵泡存活率，從而改善移植后卵巢組織功能。但就目前數據分析，兩種冷凍方法用于卵巢組織冷凍的效果相當，尚需以活產率作為評價目標的前瞻性隨機對照試驗來進一步證實[26]。

卵巢組織凍存后移植可分為原位(盆腔或卵巢髓質或腹膜窗)或異位(腹壁，前臂，直腸肌等)移植。影響移植后卵巢組織壽命的因素包括：①卵巢儲備功能(與年齡相關的竇卵泡數量)。② 冷凍保存前的化療。③卵巢組織塊大小和冷凍、解凍技術。④卵巢組織中不同卵泡的分布。⑤移植后卵巢組織局部缺血損傷[19]。無論是慢速冷凍還是玻璃化冷凍卵巢組織, 均有兩個難題需要攻克:一是冷凍保護劑在卵巢組織塊內滲透性差和細胞毒性, 二是移植后組織缺血損傷和血供重建。

本課題組發現改良玻璃化冷凍NIV(needle immersed vitrification)法的冷凍效果優于程序化冷凍法及微滴法，能有效保存卵泡形態和發育潛能[27,28]。凍融小鼠卵巢組織異體移植后，與慢速冷凍法相比，NIV法可以更好地保存間質細胞、膠原束、細胞間隙及始基卵泡[27,29,30]。而卵巢組織間質細胞和基質成分的完整保存，對冷凍復蘇后卵巢組織片體外培養或移植后卵泡的支持和營養以及微循環的建立具有重要作用[27]。在此基礎上，課題組進一步探討改善卵巢組織移植后缺血再灌注損傷，提高卵巢移植物質量的方法。通過高通量蛋白芯片技術檢測凍融前后卵巢組織中多種促血管生成因子的表達量，發現凍融后間質中多種促血管生成因子水平下降，其中差異最顯著的因子是Angiogenin及bFGF( basic fibroblast growth factor)。之后建立NIV冷凍法凍融人卵巢組織短期體外培養后異種移植模型，采用免疫組織化學法檢測微血管密度、間質細胞增殖和凋亡和卵泡計數，評估移植后效果。發現NIV法凍融人卵巢組織在體外培養液中添加200ng/ml Angiogenin培養5天后異種移植后血管重建作用最佳，間質細胞凋亡降低。添加100ng/ml和150ng/ml bFGF體外培養2天后人卵巢組織異種移植后血管重建作用最佳，間質細胞增殖增加。提示添加Angiogenin及bFGF至體外培養體系中并培養適當時間，對NIV法凍融人卵巢組織短期移植后血管重建及基質保護有明顯促進作用[31]。此外,凍存卵巢組織中是否攜帶腫瘤細胞, 關系到移植安全性問題。研究表明，這主要取決于腫瘤的類型和分期，白血病、神經母細胞瘤及Burkitt 淋巴瘤患者卵巢再植后引入惡性細胞具有高風險性[32]。

3.2.4未成熟卵母細胞體外培養成熟(in vitro maturation, IVM)是指將GV期或MI期的卵母細胞在體外培養發育到第二次減數分裂中期(MII期)，能夠正常發育、受精和著床。IVM 具有治療簡單、藥物使用少、減輕患者經濟負擔、避免卵巢過度刺激等優點, 目前IVM研究已由單純基礎研究擴展到治療多囊卵巢綜合癥、卵巢高/ 低反應性、卵巢反應不齊、自然周期降低治療成本和預防促排卵不良反應、供卵、生殖保險等多個領域, 有廣闊的應用前景[33]。雖然目前研究表明人卵母細胞體外發育潛能明顯低于體內成熟, 臨床妊娠率較低，但大量研究表明IVM 是可行的[34]，近期已有活產嬰兒報道[35]。目前很多研究發現利用TGF-β因子、EGF樣因子及cAMP調控因子等的作用可以改善IVM體外培養體系，但仍需進一步縮小體外培養和體內培養間的差距[26]。

IVM技術可以聯合卵巢冷凍技術，在切割及冷凍卵巢皮質之前， 將所有可見竇卵泡中的生殖泡期(GV)卵母細胞抽吸出來，去除部分卵丘顆粒細胞，以適用于冷凍卵子的玻璃化冷凍方法對其進行保存，降低卵巢組織移植后腫瘤復發的風險。對于患雌激素依賴性腫瘤和需要盡快行抗腫瘤治療而不允許促排卵的患者，可在抗腫瘤治療前取出小卵泡并行IVM，將所獲得的成熟卵或胚胎進行玻璃化冷凍，且取卵時機不受月經周期時相的限制[10]。

3.2.5卵巢體外激活(in vitro activation，IVA)將患者卵巢組織玻璃化冷凍保存，取出1～2塊組織剪碎為大小1～2 mm2的碎片約100塊。將40～80塊碎片移植入患者輸卵管漿膜層下。超聲監測卵泡發育生長情況，給予卵泡刺激素(FSH)刺激，待發現植入組織正常生長后行促排卵。IVA的機制目前認為與海馬腫瘤抑制通路有關。海馬腫瘤抑制通路可以調控人體內器官大小，此通路的失調將導致組織器官的增長。而對取出的卵巢組織實施剪碎處理的過程能夠刺激海馬通路并促使結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF/CCN2)表達增多，從而激發卵巢碎片的生長，促進卵泡生長發育[36，37]。雖然IVA技術仍處于探索階段，仍需要更多的研究以證實IVA技術的安全性，但對于卵巢功能已經衰退的患者具有重要意義。

3.3藥物治療主要指激素治療，包括下丘腦促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)、孕激素、抗雌激素制劑和芳香化酶抑制劑等。GnRH-a一般主張在化療前7～10 d使用[38]，可抑制下丘腦- 垂體- 卵巢軸，使大部分卵泡處于靜息狀態，減小化療藥物對生長期卵泡的損傷[16]；抑制FSH 分泌，減少子宮卵巢血流灌注，激活卵母細胞GnRH 受體，上調性腺內抗凋亡分子和(或)保護未分化的胚胎干細胞[10]。Del等使用GnRH 激動劑暫時抑制卵巢功能， 可顯著降低化療導致年輕腫瘤患者發生POF 的危險性[39]。雌激素受體陽性的惡性腫瘤患者應禁用GnRH-a，若仍需使用GnRH-a，也應在嚴格的風險效益評估后進行[16]。

3.4現代生物技術治療①間充質干細胞移植: 通過間充質干細胞移植技術提高烷化劑損傷卵巢的功能[40]/ ②成年小鼠及人卵巢分離雌性生殖干細胞系( female germlinestem cells，FGSC) ，通過生殖干細胞移植以來使衰竭的卵巢重獲功能[41]。干細胞技術的不斷探索有望使育齡期放化療病人重獲卵巢功能。

4小結與展望

女性生育力保存技術大大改善了腫瘤等疾病康復者生育需求和生殖健康。在多種生育力保存措施中，生育力保存手術、藥物治療、胚胎冷凍、卵母細胞冷凍、卵巢組織冷凍和體外成熟培養的聯合應用, 以及體外激活技術和干細胞技術的不斷發展和應用，為保存女性生育力提供了更加靈活、可行的方案,是將來的發展趨勢。

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New progress of female fertility preservation

LI Shangwei

(ReproductiveMedicineCenter,WestChinaSecondUniversityHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】The current female fertility declined on the whole, and this trend affected women′s reproductive health and the quality of life at the same time. Reproductive health and fertility preservation is increasingly becoming the focus of social attention. Fertility-sparing surgery is accepted by more and more gynecology tumor patients. Improvement of embryo, oocyte and ovarian tissue cryopreservation provides feasible methods for fertility preservation. And the exploration in vitro maturation, in vitro activation and stem cell technology provide broader thinking for fertility preservation. This article is a review about the influence factors of female fertility, indications for fertility preservation technology and the main method and progress of fertility preservation.

【Key words】Fertility preservation; Female; Fertility-sparing surgery; Cryopreservation; Review

基金項目：國家自然科學基金(31171442)

【中圖分類號】R 715.5

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.001

(收稿日期：2016-02-26； 編輯： 張文秀)

執行編委簡介：李尚為，女，四川大學華西二院教授，博士生導師, 生殖醫學中心學科主任，四川省學術和技術帶頭人，享受國務院政府特殊津貼專家。中華醫學會生殖醫學分會第一、二屆常務委員，曾擔任中華醫學會生殖醫學分會管理與倫理學組副組長，現任中華醫學會生殖醫學分會臨床學組委員，中華醫學會婦產科內分泌學組委員，中華醫學會四川省生殖醫學專委會主任委員，《西部醫學》編委。1993年～1994年赴日本神戶大學高級訪問學者，在四川省率先開展生殖醫學輔助生殖技術臨床及前沿基礎研究。1997年獲得四川省首例試管嬰兒成功誕生，1999年獲得西南地區首例卵巢早衰的絕經婦女贈卵試管嬰兒成功；獲國家自然科學基金，國家“十二五”及“十一五”科技支撐項目等國家級及省級課題20余項；國家發明專利1項，省科技進步獎2項，參編教材及專著多部，國內外知名期刊發表論文百余篇，其中SCI收錄20余篇。培養博士、碩士研究生50余名。E-mail: lswivf01@sina.com