2-脫氧葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)人γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)及殺傷功能影響①

鄭　璐　陳永強(qiáng)　劉軍權(quán)　呂小婷　張　娟　孫蕾清　徐　晶　周忠海　陳復(fù)興

(解放軍第97醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，徐州221004)

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2-脫氧葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)人γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)及殺傷功能影響①

鄭璐陳永強(qiáng)②劉軍權(quán)呂小婷張娟孫蕾清徐晶周忠海陳復(fù)興

(解放軍第97醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，徐州221004)

陳復(fù)興(1953年-)，男，主任技師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:chenfuxingTITC@163.com。

[摘要]目的：觀察糖基化抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)對(duì)γδT細(xì)胞增殖、趨化因子受體CCR5和殺傷功能的影響。方法：從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，加入到γδT細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得γδT細(xì)胞。用不同濃度的2-DG誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT細(xì)胞48 h后，用CCK-8法測(cè)定不同濃度2-DG組的γδT細(xì)胞增殖和殺傷能力；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)和殺傷功能指標(biāo)的影響。結(jié)果：培養(yǎng)10 d后的γδT細(xì)胞純度達(dá)到(88.18±3.41)%。2-DG濃度在0~1.0 mmol/L時(shí)對(duì)γδT細(xì)胞的增殖影響不明顯，而當(dāng)濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細(xì)胞的增殖。2-DG濃度在0~2.0 mmol/L范圍內(nèi)能促進(jìn)CCR5的表達(dá)，且在0.5和1.0 mmol/L時(shí)能促進(jìn)殺傷指標(biāo)CD107a和穿孔素的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)論：2-DG能促進(jìn)γδT細(xì)胞表面趨化因子受體CCR5的表達(dá)，且在一定濃度范圍內(nèi)能提高γδT細(xì)胞的體外殺傷功能。

γδT細(xì)胞是近年來(lái)研究較多的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，它主要分布于黏膜和上皮組織內(nèi)，外周血中僅占單個(gè)核淋巴細(xì)胞0.5%~5%。γδT細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，以組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC) 非限制性方式識(shí)別腫瘤抗原從而發(fā)揮殺傷作用，受腫瘤主要免疫逃逸機(jī)制影響較小[1]。體外常規(guī)擴(kuò)增的γδT細(xì)胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效[2,3]。為了提高γδT細(xì)胞治療腫瘤效果，需要獲得足夠數(shù)量并能使回輸?shù)襟w內(nèi)后能迅速有效的遷移到腫瘤局部發(fā)揮抗腫瘤作用。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)為葡萄糖類似物，具有抗腫瘤、抗病毒和細(xì)菌感染及延緩衰老等作用[4]。最近Sukumar等研究發(fā)現(xiàn)2-DG抑制糖代謝獲得在體內(nèi)能快速分布并長(zhǎng)久存活和較強(qiáng)抗腫瘤活性的記憶CD8+T細(xì)胞[5]。而CCR5為趨化因子 CC 受體家族成員，屬 7 次跨膜 G 蛋白耦聯(lián)受體，主要表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，與其配體介導(dǎo) CCR5+免疫細(xì)胞的趨化、募集和免疫過(guò)程[6,7]。因此，本研究想觀察2-DG能否促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)以及對(duì)γδT細(xì)胞的增殖和殺傷功能的影響，旨在獲得向腫瘤組織高趨向性和高殺傷活性的γδT細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)購(gòu)自Sigma公司，用RPMI1640培養(yǎng)基溶解配制母液為1 mol/L，-20℃儲(chǔ)存；RPMI1640和小牛血清購(gòu)自Gibco 公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)和唑來(lái)磷酸購(gòu)自諾華制藥公司；熒光抗體FITC-γδTCR、PE-CCR5、PE-CD107a和PE-穿孔素購(gòu)自eBioscience；人AB型血清購(gòu)自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT細(xì)胞的培養(yǎng)取抗凝外周血20 ml，加入淋巴細(xì)胞分離液，分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。將PBMCs加入含10%小牛血清、5% AB血清、5 μmol/L的唑來(lái)膦酸和300 U/ml的rhIL-2的γδT培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每3 d補(bǔ)加更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2γδT細(xì)胞鑒定將培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，并用FITC-γδTCR 抗體標(biāo)記細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行γδT細(xì)胞鑒定。

1.2.32-DG對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.0×105ml-1，取180 μl 接種于96孔板，加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L 2-DG，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于450 nm 處測(cè)定光密度值。

1.2.42-DG對(duì)γδT細(xì)胞上顆粒酶和穿孔素的表達(dá)將γδT細(xì)胞配成濃度為1.0×105ml-1的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L的2-DG，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，每管加入anti-γδTCR-FITC 10 μl,避光孵育20 min。加入100 μl固定液室溫避光孵育15 min，PBS洗滌1次。每管加100 μl破膜液,10 μl anti-穿孔素-PE 抗體及anti-顆粒酶B-PE 抗體，室溫避光孵育15 min,PBS洗滌后,重懸于0.5 ml的PBS溶液中，分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顆粒酶和穿孔素的表達(dá)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.52-DG對(duì)γδT細(xì)胞上CD107a和CCR5的表達(dá)將γδT細(xì)胞配成濃度為1.0×105ml-1的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L的2-DG，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，每管分別加入10 μl的anti-γδTCR-FITC、anti-CCR5-PE和anti-CD107a-PE，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCR5和CD107a的表達(dá)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.62-DG對(duì)γδT細(xì)胞殺傷HCT116細(xì)胞活性的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞作為靶細(xì)胞，接種于96孔板中密度為5×103/孔，以10∶1的效靶比分別加入γδT細(xì)胞，總體積為200 μl/孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組和靶細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共同孵育24 h后，加入CCK-8液20 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)光密度值。

2結(jié)果

2.1γδT細(xì)胞鑒定和2-DG對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用γδT細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d 后γδT細(xì)胞開始增殖，10 d后出現(xiàn)許多大小不同的細(xì)胞集落，細(xì)胞成梭形(圖1A)。用流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果如圖1B顯示，γδT細(xì)胞比率達(dá)(88.18±3.41)%。以上結(jié)果提示γδT 細(xì)胞培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　2-DG對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響Fig.1　Effect of treatment of 2-DG on γδT cell proliferative responseNote: *.P<0.01.

圖2　2-DG對(duì)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)的影響Fig.2　Effect of 2-DG on expression of CCR5 in γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1C)：經(jīng)不同濃度的2-DG作用γδT細(xì)胞48 h后，2-DG濃度在0~1.0 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)γδT細(xì)胞的增殖影響不明顯(P>0.05)，而當(dāng)濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細(xì)胞的增殖(P<0.01)。

2.22-DG促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)CCR5是表達(dá)于γδT淋巴細(xì)胞表面的主要趨化因子受體蛋白之一，介導(dǎo) CCR5+γδT細(xì)胞的趨化、募集和免疫過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，2-DG作用γδT細(xì)胞48 h后，能顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞表面CCR5受體的表達(dá)，且具有劑量依賴性(P<0.05,P<0.01),見圖2。

2.32-DG對(duì)γδT細(xì)胞中顆粒酶、穿孔素和CD107a表達(dá)的影響2-DG作用γδT細(xì)胞48 h后,流式檢測(cè)結(jié)果如圖3顯示,經(jīng)0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的2-DG作用后，γδT細(xì)胞穿孔素和CD107a的陽(yáng)性表達(dá)率較對(duì)照組升高，以濃度1.0 mmol/L濃度最明顯分別為(62.47±2.29)%和(52.45±2.08)%，與對(duì)照組(46.35±2.31)%和(43.39±1.83)%比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而在0~2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)顆粒酶的表達(dá)影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3　2-DG作用γδT細(xì)胞48 h后對(duì)CD107a和穿孔素表達(dá)的影響Fig.3　Effect of 2-DG on expression of CD107a and perforin in γδT cells

圖4　2-DG處理后的γδT細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞殺傷效應(yīng)Fig.4　Killing activities of γδT cells treated with 2-DG against HCT116 cells

2.4γδT細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞殺傷作用經(jīng)0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的2-DG處理48 h后的γδT細(xì)胞，在效靶比為10∶1時(shí)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的殺傷率分別為：(49.28±2.76)%和(57.92±3.17)%。與對(duì)照組(38.34±2.16)%相比，經(jīng)2-DG處理后的γδT細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞殺傷效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)，見圖4。

3討論

γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中表達(dá)γδTCR的一個(gè)亞群，約占外周血T淋巴細(xì)胞的0.5%~5%，在機(jī)體的抗感染、抗腫瘤和免疫監(jiān)視等方面起到重要作用[8]。因γTδ 細(xì)胞能夠識(shí)別腫瘤表達(dá)的磷酸化抗原和應(yīng)激抗原等，能通過(guò)穿孔素和顆粒酶以及NKG2D等途徑殺傷多種腫瘤細(xì)胞，因此近年來(lái)體外常規(guī)擴(kuò)增的γδT細(xì)胞成為腫瘤過(guò)繼免疫治療的重要候選細(xì)胞[9]。為了提高γδT細(xì)胞治療效果，目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中于通過(guò)多種細(xì)胞因子和中藥單體化合物等進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)γTδ細(xì)胞及條件優(yōu)化，來(lái)提高γTδ細(xì)胞的體外增殖倍數(shù)及殺傷功能[10-14]。然而，臨床回輸?shù)摩肨δ 細(xì)胞在體內(nèi)有效地遷移到腫瘤局部，是發(fā)揮免疫監(jiān)視和抗腫瘤活性的一個(gè)重要條件。

CCR5 為趨化因子 CC 受體家族成員，主要表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞且在γδT 細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于αβT 細(xì)胞，與其配體為CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP-1β)、CCL5(RANTES)介導(dǎo)CCR5+免疫細(xì)胞的趨化、募集和免疫過(guò)程[4,5]。康寧等[15]研究人員發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的 γTδ細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子受體 CCR5，而且還發(fā)現(xiàn)CCR5 的配體CCL3、CCL4 和 CCL5三種趨化因子在部分結(jié)直腸癌標(biāo)本中高表達(dá)，提示了其募集 γδT細(xì)胞的可能性。另外，γδT細(xì)胞還具有抗原提呈功能，荷載腫瘤抗原的γδT細(xì)胞高表達(dá)CCR5可能會(huì)增強(qiáng)其誘發(fā)機(jī)體適應(yīng)性抗腫瘤免疫能力，為γδT細(xì)胞腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用提供支持[16]。

本研究中發(fā)現(xiàn)2-DG在0~1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)γδT細(xì)胞的增殖影響不明顯，相反當(dāng)濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細(xì)胞的增殖。殺傷活性僅在2-DG濃度為 0.5 mmol/L和1.0 mmol/L時(shí)，可以提高γδT細(xì)胞穿孔素、CD107a的陽(yáng)性表達(dá)率和對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的體外殺傷力。而在0~2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)，2-DG能顯著地促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)，且具有劑量依賴性，提示用2-DG誘導(dǎo)培養(yǎng)的γδT細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后可能具有更好的腫瘤組織趨向性。

本研究結(jié)論是1.0 mmol/L的 2-DG作用γδT細(xì)胞48 h后，在不影響γδT細(xì)胞增殖的情況下能獲得高殺傷活性和高表達(dá)CCR5+γδT細(xì)胞。我們研究結(jié)果為進(jìn)一步提高γδT細(xì)胞治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而有關(guān)該群細(xì)胞具體的生物學(xué)特性、體內(nèi)趨向性和抗腫瘤療效等有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-06-06]

(編輯張曉舟)

[關(guān)鍵詞]2-DG;γδT細(xì)胞;CCR5；殺傷功能

Effect of 2-deoxy-D-glucoseon on expression of CCR5 and killing function of human γδT cells in vitro

ZHENGLu,CHENYong-Qiang,LIUJun-Quan,LüXiao-Ting,ZHANGJuan,SUNLei-Qing,XUJing,ZHOUZhong-Hai,CHENFu-Xing.DepartmentofCentralLaboratory,97thHospitalofPLA,Xuzhou221004,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) on hunman γδT cells on the expression of CCR5 and killing function in vitro.Methods: Using γδT medium to cultivate peripheral blood mononuclear cell(PBMCs) in vitro.After co-cultured with various concentrations of 2-DG for 48 h,the expression of CCR5 and killing activities of γδT cells for each group were detected by flow cytometry and CCK-8 methods.Results: 2-DG could not promote the growth of γδT cells with the increase in concentration from 0 μmol/L to 1.0 μmol/L and decreased thereafter.The certain concentration (0-2.0 μmol/L) of 2-DG could upregulate the expression of CCR5 in dose dependent manner.Besides，at 0.5 μmol/L and 1.0 μmol/L of 2-DG could increase the expression of CD107a and perforin and have no effect on the granzyme B.Conclusion: Human γδT cells isolated from peripheral blood treated with 2-DG could promote the expression of CCR5 and increase the killing activities at certain concentration in vitro.

[Key words]2-DG;γδT cells;CCR5;Killing function

通訊作者及指導(dǎo)教師：周忠海(1973年-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:zhouzhonghai298@aliyun.com。

作者簡(jiǎn)介：鄭璐(1985年-)，女，碩士，主管技師，主要從事分子藥理學(xué)方面的研究，E-mail:xsdzhenglu@163.com。

中圖分類號(hào)R392.12
①本文受南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新研究基金(14MS032) 資助。
②并列第一作者。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0029-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.006