P53抑制劑和微管抑制劑對銀屑病表皮角質形成細胞糖皮質激素受體核轉運的影響

張育華　黃文暉　莫菊彩

(臺州市腫瘤醫院皮膚科，臺州317502)

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P53抑制劑和微管抑制劑對銀屑病表皮角質形成細胞糖皮質激素受體核轉運的影響

張育華黃文暉①莫菊彩②

(臺州市腫瘤醫院皮膚科，臺州317502)

[摘要]目的：探討P53抑制劑和微管抑制劑對銀屑病表皮角質形成細胞糖皮質激素受體(GR)核轉運的影響。方法：分離和培養銀屑病患者和正常人表皮角質形成細胞，分別與P53抑制劑和微管蛋白抑制劑共培養，加或不加血管內皮細胞生長因子(VEGF)，間接免疫熒光法檢測上述因素對GR核轉位的影響。結果：VEGF可誘導正常角質形成細胞發生核轉位；P53抑制劑抑制了VEGF誘導的GR核轉位。與VEGF共培養的角質形成細胞的核轉位評分顯著低于單純角質形成細胞的核轉運評分，差異有統計學意義(P<0.05)；微管抑制劑可完全將正常表皮角質形成細胞的GR滯留在胞漿中，在加入VEGF后，與單純微管抑制劑組比較，胞漿中GR并沒有明顯增多；而微管抑制劑和P53抑制劑共培養，會有少量GR進入角質形成細胞的胞核中。結論：微管介導銀屑病角質形成細胞GR的核攝取，P53參與了 GR的核輸出。

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，常常伴有冠心病、高血壓、代謝綜合征等系統性疾病[1]，需積極治療以改善患者的預后。糖皮質激素具有強大的抗炎作用，為治療銀屑病的最常用藥物，雖可有效改善皮損，但停藥后容易反彈[2]，故加強對糖皮質激素治療銀屑病機制的研究十分重要。糖皮質激素發揮其抗炎作用，需糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)的參與，研究發現GR能夠在細胞漿和細胞核之間穿梭，但糖皮質激素發揮抗炎作用則需要GR轉位至細胞核中[3]。目前研究發現，血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor)可誘導正常表皮角質形成細胞的GR從細胞核內轉運至細胞漿中[4]，但是VEGF不能誘導HaCaT細胞核內GR轉運到胞漿中。HaCaT細胞與正常表皮角質形成細胞最大的不同在于HaCaT細胞的P53等位基因均發生了突變[5]，提示P53蛋白可能參與了 GR的核質轉運過程。微管是一種具有極性的細胞骨架，具有細胞內物質運輸的路軌作用，可影響細胞內蛋白轉運和細胞運動[6]，故推測微管可能參與了GR的核轉運。因此，本研究探討P53抑制劑和微管抑制劑對銀屑病表皮角質形成細胞GR核轉運的影響，為進一步了解GR核轉運的影響因素，為研制治療銀屑病的新藥物提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑微管抑制劑、P53抑制劑、碘化丙啶、FITC標記購至美國Sigma公司，VEGF購至美國Pepro Tech公司。

1.1.2儀器CO2培養箱、細胞培養瓶、培養板等細胞培養相關器械購自美國Falcon公司，奧林巴斯熒光顯微鏡購自北京中儀光科科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標本收集在患者知情同意下，標本取自慢性斑塊型銀屑病患者皮損區皮膚。患者納入標準：①重度斑塊型銀屑病；②銀屑病皮損面積和嚴重程度指數≥10分；③取標本前1個月未曾使用過任何藥物治療。排除標準：心臟、腦、肝、腎、造血系統異常；②合并腫瘤性疾病。共30例銀屑病患者，其中男9例，女21例；年齡(42.65±14.43)歲。正常對照組皮膚取自整形外科健康成人，共30例，其中男6例，女24例，年齡(42.43±14.36)歲。銀屑病患者與正常對照組的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所取標本分為兩部分，一部分立即置于0.5% dispase分離酶中，4 ℃孵育過夜；另一部分保存在-80℃冰箱中用于免疫熒光檢測。

1.2.2細胞培養無菌操作臺內分離0.5%分離酶中4 ℃孵育過夜的表皮和真皮，將分離下的表皮置于0.25% 的胰酶中，37℃，10 min。然后用10% 的胎牛血清輕輕吹打表皮,以200目濾網過濾角質形成細胞懸液，1 000 r/min,離心5 min。然后,棄上清,加入defined KSFM,將細胞種植于37℃的5% CO2孵育箱中培養和傳代。實驗使用第2~3代的細胞。

1.2.3免疫熒光將經冷凍切片機切好的4 μm切片轉移到預先處理的蓋玻片表面，用4%多聚甲醛室溫固定組織切片20 min，PBS洗3次，加入10 mmol/L枸櫞酸納緩沖液95℃，加熱20 min，PBS洗3次，加入10%胎牛血清室溫封閉1 h，加兔抗人GR抗體(1∶200)4℃過夜。PBS洗3次，加入FITC標記的山羊抗兔二抗(1∶50)避光下室溫孵育2 h。PBS洗3次，碘化丙啶復染10 min，封片，在熒光顯微鏡下觀察并評分。

1.2.4核轉位評分標準在熒光顯微鏡下選擇5個不同視野進行評分。核內熒光顯著弱于胞漿內熒光為0分；核內熒光弱于胞漿內熒光為1 分；核內熒光與胞漿內熒光相當為2 分；核內熒光強于胞漿內熒光為3 分；核內熒光顯著強于胞漿內熒光為4 分。最后以5個視野的平均分作為最后得分。

1.2.5P53和微管蛋白抑制劑對表皮角質形成細胞的影響正常和銀屑病表皮角質形成細胞與P53和微管蛋白抑制劑孵育24 h，加或不加VEGF，固定細胞后用于免疫熒光檢測。

2結果

2.1P53抑制劑對VEGF誘導的GR核轉位的影響如圖1所示，VEGF誘導正常角質形成細胞發生核轉位(A)；VEGF不能抑制HaCaT細胞的GR核轉位(B)；P53抑制劑抑制了VEGF誘導的GR核轉位(C)。與VEGF共培養的角質形成細胞的核轉位評分顯著低于單純角質形成細胞的核轉運評分，差異有統計學意義(P<0.05)；與VEGF共培養的 HaCaT細胞和P53抑制劑預處理的角質形成細胞的核轉位評分與單純HaCaT細胞和P53抑制劑預處理的角質形成細胞的核轉位評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2微管抑制劑對GR核攝取的影響微管抑制劑可完全將正常表皮角質形成細胞的GR滯留在胞漿中，在加入VEGF后，與單純微管抑制劑組比較，胞漿中GR并沒有明顯增多；而微管抑制劑和P53抑制劑共培養，會有少量GR進入角質形成細胞的胞核中，見圖2。

圖1　P53抑制劑對VEGF誘導的GR核轉位的影響Fig.1　Effect of P53 inhibitors on nuclear export of glucocorticoid receptor

表1各組別的核轉位評分比較

Tab.1Comparison of nuclear translocation score of each group

GroupsControlVEGFKeratinocytes3.96±0.240.51±0.061)HaCaTcells3.89±0.223.84±0.25Keratinocytes+P53inhibitors3.67±0.193.63±0.17

Note：Compare with the control group,1)P<0.05.

圖2　微管抑制劑對GR核攝取的影響Fig.2　Effect of microtubule inhibitors on nuclear uptake of glucocorticoid receptor

3討論

近年來，雖然有很多治療銀屑病的新藥問世，但糖皮質激素由于其較強的抗炎作用，仍為治療銀屑病的一線用藥。目前研究已經認識到糖皮質激素發揮作用必須有GR的參與，GR從胞漿轉運至胞核才能使糖皮質激素發揮作用[3]。因此，研究銀屑病角質形成細胞GR轉運的影響因素具有重要意義，有利于開發治療銀屑病的新藥。

本研究發現，VEGF誘導正常角質形成細胞發生核轉位，但卻不能抑制HaCaT細胞的GR核轉位，這與既往研究結果相似[4]。HaCaT細胞與正常表皮角質形成細胞最大的不同在于HaCaT細胞的P53等位基因均發生了突變[5]，提示P53蛋白可能參與了 GR的核質轉運過程。本研究進一步對正常角質形成細胞與P53抑制劑共培養，提示VEGF卻不能誘導GR的核轉位，證明P53影響銀屑病角質形成細胞GR核轉運。

微管是一種具有極性的細胞骨架，具有細胞內物質運輸的路軌作用，可影響細胞內蛋白轉運和細胞運動[6]，然而，微管在活化GR核轉運過程中的作用尚存在爭議[7]。雖然有研究提示微管在活化GR核轉運過程中的作用[8]，胞漿中GR是沿著細胞骨架通道運動的,與微管結合形成異多聚復合物。但是，在HeLa細胞和大鼠的胸腺細胞中,微管或微絲的破壞并不足以誘導未結合受體的核運輸,更不能破壞已結合配體受體的核運輸[9]。本研究結果顯示，微管功能的破壞足以導致正常表皮角質形成細胞中的GR滯留在胞漿中。在微管抑制預處理的角質形成細胞中,GR不能在胞漿和胞核之間轉運穿梭，提示微管抑制劑破壞了正常表皮角質形成細胞中GR的核質轉運,并抑制了GR的核攝取。微管蛋白與GR的動態相互作用對于GR從胞漿中運動到細胞核內至關重要。因此，本研究為從微管角度研究治療銀屑病的藥物提供了理論依據。然而，本研究尚未探討加入糖皮質激素和細胞因子對角質形成細胞GR核轉運的影響，仍需進一步深入研究。

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[收稿2015-03-20修回2015-06-25]

(編輯倪鵬)

[關鍵詞]銀屑病；糖皮質激素受體；P53抑制劑；微管抑制劑

Effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes

ZHANGYu-Hua,HUANGWen-Hui,MOJu-Cai.DepartmentofDermatology,TumorHospitalofTaizhou,Taizhou317502,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes.Methods: Isolate and culture psoriatic and normal epidermal keratinocytes.The keratinocytes were incubated with P53 inhibitors and microtubule inhibitors with or without vascular endothelial growth factor(VEGF),and then detected the distribution of GR by indirect immunofluorescence.Results: VEGF induced nuclear translocation of GR in normal keratinocytes,and the P53 inhibitor restrained VEGF induced nuclear export of GR in normal keratinocytes.The nuclear translocation score of the keratinocytes cultured with VEGF was significantly lower than that of keratinocytes cultured without VEGF(P<0.05).The microtubule inhibitors could completely detained GR of normal epidermal keratinocytes in the cytoplasm,and there′s no significantly increased of the level of GR in the cytoplasm after putting VEGF into the normal epidermal keratinocytes.While the microtubule inhibitors and P53 inhibitors co-cultured,there will be a small amount of GR into the keratinocyte nuclei.Conclusion: Microtubule mediated uptake of GR,P53 participated nuclear export of GR.

[Key words]Psoriasis;Glucocorticoid receptor;P53 inhibitor;Microtubule inhibitors

作者簡介：張育華(1978年- )，男，副主任醫師，主要從事皮膚科臨床工作，E-mail：zhangyuhuaedu@126.com。

中圖分類號R758.63
①臺州中西醫結合醫院皮膚科，臺州317500。
②臺州市腫瘤醫院藥劑科，臺州317502。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0101-03

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.022