艾灸足三里脊髓響應通路的實驗研究

王 明 蔡 輝 吳煥淦 余 芝 王欣君 陳智宇 金傳陽 張建斌,3

(1 南京中醫藥大學第二臨床醫學院，南京，210023； 2 上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所，上海，200030；3 江蘇省第二中醫院，南京，210017)

艾灸足三里脊髓響應通路的實驗研究

王 明1蔡 輝1吳煥淦2余 芝1王欣君1陳智宇1金傳陽1張建斌1,3

(1 南京中醫藥大學第二臨床醫學院，南京，210023； 2 上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所，上海，200030；3 江蘇省第二中醫院，南京，210017)

目的：研究艾灸“以溫促通”的傳入通路與脊髓背角神經元響應的關系。方法：選用成年雄性SD大鼠40只，玻璃微電極細胞外記錄L4節段脊髓背角神經元活動(放電頻率)，分別給予足三里肌注150 μL的0.01M辣椒素(Capsaicin，CAP)和49 ℃艾灸30 s刺激，觀察不同刺激后神經元放電的變化。結果：1)脊髓背角神經元對足三里注射辣椒素有響應，其效應特征以興奮性作用為主；2)49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素穴位注射足三里可以在脊髓背角的同一個神經元中匯聚；3)脊髓背角神經元對49 ℃艾灸的響應，也存在與足三里辣椒素注射不一致效應。結論：高溫熱灸的傳入通路和脊髓響應，部分是由辣椒素敏感的C纖維和TRPV1通道介導的。

艾灸；足三里；傳導通路；辣椒素

艾灸施術簡便，療效顯著，古今臨床廣泛應用。在艾灸現代原理研究中，施灸部位的溫熱刺激及其產生的溫通效應，受到關注，并形成了“以溫促通”的艾灸溫通理論[1-2]。但是，從施灸部位的溫熱刺激到溫通效應產生的通路和環節尚不十分清晰。1997年，一個能被辣椒素(Capsaicin，CAP)激活的受體被克隆，被稱為辣椒素受體。根據其離子通道特性，此受體屬于瞬時感受器電位離子(Transient Receptor Potentia1，TRP)通道家族，主要存在于溫度敏感神經元等，對外周和中樞溫度信息起著重要介導作用[3-5]。TRPV1是TRP的重要亞型，分布于全身，包括大腦、脊髓以及外周神經系統，可被大于43 ℃的熱刺激激活，因此也被稱為“熱敏感”通道[6-7]。

艾灸“以溫促通”的傳入通路，首先應該是由施灸部位或穴位局部到脊髓中樞的過程。脊髓背角神經元對外周施灸刺激的響應，是艾灸“以溫促通”的關鍵環節之一，脊髓背角TRPV1陽性神經元激活可能是艾灸“以溫促通”的脊髓中樞調制環節。本實驗通過電生理學技術和手段，研究外周穴位施灸后的脊髓背角神經元響應，探索“以溫促通”的傳入通路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD成年大鼠40只，體質量300～450 g，由南京中醫藥大學提供(許可證號：GCXK(滬)2013-0016)，在室溫(22±2)℃、光照8:00—20：00、自由進食飲水等同等標準環境下飼養1周。

1.2 實驗儀器 腦立體定位儀(David Kopf Instruments，美國)，微電極操作器控制(NARISHIGE，日本)，細胞外電生理記錄放大器(A-M systmes，美國)，Micro3-1401生理信號采集分析系統(CED，英國)，玻璃微電極拉制儀(WD-1，成都儀器廠)，玻璃微電極(長度100 mm，外徑1.2 mm，南京市泉水教學實驗器材廠)，純艾條(南陽市臥龍漢醫艾絨廠)，紅外測溫儀(Fluke 566)。

1.3 實驗試劑 烏拉坦(氨基甲酸乙酯，上海青析化工科技有限公司)，滂胺天藍(Sigma，美國)，無水乙酸鈉(南京化學試劑有限公司)，辣椒素(Sigma，美國)，吐溫80(南京化學試劑有限公司)，無水乙醇(南京化學試劑有限公司)，生理鹽水(南京化學試劑有限公司)，石蠟油(南京化學試劑有限公司)。

1.4 細胞外記錄方法 將麻醉大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，用咬骨鉗開脊髓，暴露大鼠第四腰椎，用手術顯微鑷剝離硬脊膜，用蘸有生理鹽水的棉球小心地將周圍的血擦干凈，注意操作中盡可能的避免碰到脊髓，剝離硬脊膜后盡快滴38 ℃左右的石蠟油防止脊髓水分蒸發。實驗過程中，用加熱板維持大鼠體溫在(37±0.5)℃。手術完成后，休息30 min等待大鼠狀態平穩。拉制玻璃微電極(尖端直徑1～2 μm,內含0.5 mol/L的醋酸鈉灌注和2%的膀胺天藍，阻抗為5～10MΩ)，并固定于微電極操作器上，通過微電極操作器(步進1 μm/s)控制到達脊髓背角(前正中裂旁開：0.5～1.0 mm，深度：250～1 500 mm。)，探查神經元，進行細胞外記錄。干預前記錄30 s作為基線對照。記錄的放電信號經前置放大器放大后，輸入多道生理信號采集系統，使用Spike2軟件系統進行數據采集及分析，通過比較干預反應時間內神經元放電頻率變化率來判斷神經元的反應。放電頻率計算率計算公式為：(干預時-干預前)/干預前×100%，變化率的絕對值≥15%視為興奮/抑制，<15%視為無變化。

1.5 取穴和刺激方法 參照《實驗針灸學》[8]取大鼠左側“足三里”，記錄到穩定的神經元放電后，先記錄30 s，然后依次開始注射150 μL的0.01M辣椒素和49 ℃艾灸(30 s)。每個干預均等到神經元放電恢復到干預前水平后才開始下一個干預刺激。在以上記錄過程中，隨時補充38 ℃的溫石蠟油保持脊髓濕潤，并保持安靜，以減少周圍環境的干擾。

1.6 統計學方法 采用SPSS 23統計軟件進行分析，計量數據用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，計數資料比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脊髓背角神經元對辣椒素的響應 在40只大鼠的脊髓L4段，共記錄到自發穩定放電的脊髓背角神經元共60個，其中46個(76.67%)對辣椒素有反應。46個有反應的神經元中，38個(82.61%)神經元對辣椒素刺激產生了興奮放電，8個(17.39%)神經元對該刺激產生了抑制放電。放電頻率特征見表1。

表1 脊髓背角神經元對辣椒素的響應±s)

2.2 脊髓背角神經元對49 ℃艾灸的響應 在40只大鼠脊髓背角L4段60個自發穩定放電的神經元中，24個(40.00%)對49 ℃艾灸30 s有反應。24個有反應的神經元中，18個(75.00%)神經元對49 ℃艾灸產生了興奮放電；6個(25.00%)神經元對該刺激產生了抑制放電。放電頻率特征見表2。

表2 脊髓背角神經元對49 ℃艾灸的響應±s)

2.3 脊髓背角神經元接受不同刺激后效應特征 在40只大鼠脊髓背角L4段60個自發穩定放電的神經元中，分別有46個、24個神經元對0.01M辣椒素150 μL足三里穴位注射和49 ℃艾灸30 s有響應，經卡方檢驗，兩者效應特征差異有統計學意義(P<0.05)。在有響應的脊髓背角神經元中，對足三里辣椒素注射和49 ℃艾灸30 s均以興奮性響應為主，但也有少量神經元產生抑制響應。刺激后效應特征見表3，圖1、圖2。

表3 脊髓背角神經元接受不同刺激后效應特征

注：*為與49 ℃艾灸興奮性神經元進行對比P<0.05。

值得注意的是，在24個對49 ℃艾灸有響應的神經元中，有6個(25.00%)神經元對辣椒素注射無響應；在38個對辣椒素產生興奮性響應的神經元中，對49 ℃艾灸30 s刺激產生興奮性響應的神經元有10個，抑制性響應的4個，占全部艾灸響應神經元的58.33%(14/24)。

圖1 脊髓背角神經元接受不同刺激后效應特征

圖2 脊髓背角神經元接受刺激后變化圖

注：A為注射辣椒素后神經元興奮的變化圖；B為注射辣椒素后神經元抑制的變化圖；C為49 ℃艾灸后神經元興奮的變化圖；D為49 ℃艾灸后神經元興奮的變化圖。

3 討論

足三里穴廣泛應用于消化系統、神經系統、心腦血管系統等疾病，其結構基礎與神經支配和和相應的中樞傳入傳出有關。足三里穴所在區的皮膚和肌肉由脊髓L4-S2段發出的腓淺、腓深神經支配[9]。研究發現，用辣根過氧化物酶逆行追蹤足三里穴位的脊髓投射節段為T12-S2，尤其以L5-S2的標記最多[10]。研究還發現，大鼠脊髓背根L4-S1切斷后，針刺足三里對胃平滑肌電的改善作用呈顯著減弱，即足三里的效應被抑制[11]。因此，脊髓背角L4-S2段是針灸足三里穴的初級傳入中樞，在足三里穴區的各種刺激，可以通過傳入通路在脊髓背角L4-S2段得到響應。本實驗也證實，49 ℃艾灸足三里穴區，可以激活大鼠脊髓L4段背角神經元，L4段脊髓背角神經元是艾灸足三里“以溫促通”傳入通路的主要響應靶區之一。

本實驗還證實，大鼠脊髓L4段背角神經元除了響應足三里穴區49 ℃艾灸外，還可以同時響應足三里穴區的辣椒素注射。辣椒素具有明顯細胞特異性，激活神經C纖維上的非特異性離子通道——TRPV1受體，產生生物學活性[12]。辣椒素濃度的不同，對初級感覺神經元的作用不同，機體由此產生的效應也不同。低濃度的辣椒素能興奮辣椒素敏感神經元[13]；高濃度的辣椒素可以使感覺神經元失敏[14-15]。新生大鼠皮下注射50 mg/kg辣椒素是目前實驗室主要的阻斷感覺神經中痛纖維的方法。為了興奮辣椒素敏感神經元，本實驗選用0.01M(低濃度)的辣椒素，實驗結果也證實了該濃度能激活TRPV1通道，對L4脊髓背角神經元產生以興奮為主的作用。值得注意的是，在38個辣椒素興奮性神經元中，對49 ℃艾灸30 s刺激有響應的神經元有14個，占全部艾灸響應神經元的58.33%(14/24)，49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素足三里兩種干預均可以在脊髓背角的同一個神經元中匯聚，提示了49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素足三里存在共同傳入通路和相近的效應作用，都可能與TRPV1通路有關。任何形式的傷害性刺激只要達到一定強度，對組織發生損傷作用，組織就會釋放某些致痛物質，如K+、H+、組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素等，作用于游離的神經末梢，產生沖動，由傳導傷害信息的Aδ(Ⅲ)類和C(Ⅳ)類纖維傳入中樞引起痛覺[16]。49 ℃艾灸和辣椒素對足三里穴的刺激都屬于傷害性刺激，都能通過上述通道傳入中樞，實驗中有同一神經元對兩種刺激產生相同效應，也證實了共同通路的存在。

但是，實驗還提示，49 ℃艾灸足三里穴區30 s引起的脊髓背角神經元響應，與0.01M辣椒素150 μL足三里穴位注射引起的脊髓背角神經元響應，還存在不完全一致的差異。這種差異，主要表現在：1)不是全部辣椒素敏感的神經元，都響應艾灸49 ℃艾灸；2)有部分響應49 ℃艾灸的神經元，對辣椒素穴位注射不敏感；3)49 ℃艾灸足三里穴和0.01M辣椒素穴位注射，也可以分別引起神經元的抑制作用。我們分析認為，導致這種差異的原因，一方面可能與足三里穴刺激方式和刺激量有關，另一方面也與脊髓背角的神經元類型有關。高溫熱灸刺激除了具有溫熱特性能打開TRPV1通道外，還可以引起受刺激局部體表組織中某些生物活性物質含量的改變，如H+、組胺、緩激肽等，這些物理化學刺激均可以被感覺神經末梢上相應的離子通道(受體)所感知；還能在施灸穴位局部皮膚中產生與皮膚免疫相關蛋白物質如MhC-、IL-12、CD80等，這些高溫艾灸產生的物質傳入中樞的通路或許就是與辣椒素通路存在差異的地方之一。本次實驗，僅采用了49 ℃30 s艾灸足三里與0.01M辣椒素150 μL穴位注射的比較，無論是艾灸的溫度、艾灸的持續時間，都存在可變性，尚需要在今后的研究中進一步探究艾灸刺激方式和刺激量與脊髓背角神經元響應的量效關系。

綜上所述，高溫熱灸的傳導通路部分是由辣椒素敏感的C纖維介導，并且在脊髓背角部分辣椒素敏感性神經元得到響應。但是，高溫熱灸在脊髓背角神經元響應中也存在獨特的效應規律，其機制和原理，尚需要進一步的實驗支持。

[1]張建斌,王玲玲,胡玲,等.艾灸溫通作用的理論探討[J].中國針灸,2011,31(1):51-54.

[2]張建斌,王玲玲,吳煥淦,等.艾灸溫通溫補概念的內涵分析[J].中國針灸,2012，32(11)：1000-1003.

[3]Walder RY，Radhakrishnan R，Loo L，et al.TRPV1 is important for mechanical and heat sensitivity in uninjured animals and evelopment of heat hypersensitivity after muscle inflammation[J].Pain，2012，158(8)：1664-1672.

[4]Alawik，Keeble J.The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid receptor in inflammation[J].Pharmacol Ther，2010，125(2)：181-195.

[5]Baylie RL，Brayden JE.TRPV channels and vascular function[J].Acta Physiol(Oxf)，2011，203(1)：99-116.

[6]吳楠，張丹龍，衡立軍,等.TRPV1與pJNK在樹脂毒素致痛模型大鼠脊髓背角的表達變化[J].神經解剖學雜志，2015，31(2)：155-160.

[7]Romanovsky AA.Thermoregulation：some concepts have changed functional architecture of the thermoregulatory system.American journal of physiology[J].Regulatory，integrative and comparative physiology，2007，292(1)：R37-46.

[8]李忠仁.實驗針灸學[M].2版.北京：中國中醫藥出版社，2007：255-256.

[9]許巍,熊俊,陳日新,等.基于現代文獻的麥粒灸臨床治療病癥譜研究[J].遼寧中醫雜志,2016,43(3):598-600.

[10]趙敏生,余安勝,李西林.辣根過氧化物酶追蹤“足三里”穴的脊髓投射研究[J].中國針灸,1999，19(9):39-41.

[11]汪克明,王月蘭,吳子建,等.脊髓通路與針刺“足三里”效應關系的研究[C]//中國針灸學會經絡分會.中國針灸學會經絡分會第十屆學術會議論文集.中國針灸學會經絡分會,2009:2.

[12]駱昊,萬有,韓濟生.辣椒素及其受體[J].生理科學進展,2003,34(1):11-15.

[13]華興邦,何志娟,朱玲英,等.中樞機能狀態對電針效應的影響[J].南京中醫學院學報,1985(3):40-42.

[14]朱麗霞,黎春元,吉長福.辣椒素對C類神經纖維傳導的影響[J].生理科學,1988,8(5):340.

[15]劉鄉,黃平波,蔣旻春.辣椒素阻斷腓總神經C纖維的效應及其對電針“足三里”鎮痛作用的影響[J].針刺研究,1997，22(4):295-303.

[16]劉鄉.以痛制痛——針刺鎮痛的基本神經機制[J].科學通報,2001,46(7):609-616.

(2016-12-07收稿 責任編輯：洪志強)

Moxibustion in Conduction Response Pathway between Zusanli and Spinal Cord

Wang Ming1，Cai Hui1，Wu Huangan2，Yu Zhi1，Wang Xinjun1，Chen Zhiyu1，Jin Chuanyang1，Zhang Jianbin1,3

(1NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2ShanghaiUniversityofChinsesMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 3JiangsuSecondHospitalofChineseMedicine,Nanjing210017,China)

Objective:To study the relationship between the afferent pathway of moxibustion and the response of dorsal horn neurons of the spinal cord, warming the meridians to eliminate stagnation. Methods:There were 40 Adult male SD rats selected, extracellular recording the activity of spinal dorsal horn neurons of L4by glass microelectrode (discharge frequency), given intramuscular injection of 150 μl 0.01M capsaicin at Zusanli and at 49 degrees for 30 s to observe the changes of different neuron discharge before and after different stimulation. Results:1)Spinal dorsal horn neurons gave response to capsaicin stimulation, which was characterized by excitatory effect.2)49 degrees of moxibustion at Zusanli point and capsaicin injection could converge on the same neurons in the dorsal horn of spinal cord．3)The response of spinal dorsal horn neurons to the 49 degrees of moxibustion were inconsistent with that of capsaicin injection at Zusanli. Conclusion:The afferent pathway and the spinal cord response with high temperature moxibustion were mediated by capsaicin sensitive C fibers and TRPV1 channels partially.

Moxibustion；Capsaicin；Conductive pathway；Zusanli(ST36)

國家重點基礎研究發展計劃(“973”計劃)項目(編號：2009CB522905；2015CB554501)；國家自然科學基金項目(編號：81373750)

王明(1992—)，女，漢族，江蘇常州人，2010級針灸推拿七年制在讀生

張建斌(1967—)，男，漢族，江蘇無錫人，研究方向：針灸理論的臨床應用，E-mail：zhangjianbin@njucm.edu.cn

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.008