維吾爾族藥阿納其根中綠原酸的含量測定

董 潔 冀嬌嬌 王加利 袁 將 王貝貝 趙 爽 鄭尊善 劉永剛

(北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102)

維吾爾族藥阿納其根中綠原酸的含量測定

董 潔 冀嬌嬌 王加利 袁 將 王貝貝 趙 爽 鄭尊善 劉永剛

(北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102)

目的：建立測定維吾爾族藥阿納其根中綠原酸含量的高效液相色譜法(HPLC)。方法：色譜柱為Agilent 5 TC-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，以乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V)為流動相，流速為0.8 mL·min-1，紫外檢測波長為327 nm。結果：綠原酸在質量為0.0484 mg～0.968 mg范圍內呈良好線性關系，回歸方程：Y=2296316.8X-1369.4(r=0.9999)，平均回收率為100.20%，RSD=2.75%。結論：該方法簡便、靈敏、重現性好，可用于阿納其根中綠原酸的含量測定。

維藥；阿納其根；HPLC；綠原酸；含量測定

維吾爾族藥(簡稱維藥)作為民族藥之一，是中醫學寶庫的重要組成部分。維藥擁有數千年的用藥歷史，是維吾爾族人民在防病治病的過程中，積累了豐富的應用植物、動物、礦物防病與治病的實踐經驗和生產技術，并逐漸形成了獨具維吾爾族文化特色的藥物學，具有博大精深的醫學理論體系。它和中醫、藏醫等民族醫藥學相比，有著其獨特的治病理念。近些年，因其獨特的療效和深厚的文化底蘊引起越來越多的關注。但是，目前對于維藥的藥效物質基礎研究甚少，并且缺少明確的質量標準，這些都限制著維藥的進一步發展。因此，建立科學合理的維藥質量標準，對維藥現代化發展具有重要的意義。

阿納其根，據《中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊》[1]和《維吾爾藥材標準》[2]等記載，其系菊科Compositae植物羅馬除蟲菊Anayccluspyerhturm.DC.干燥的根，維藥名：阿克爾開爾哈，別名為阿吉而哈而哈、歐都里開日合、比合臺爾混庫依。主要分布于北非或南部歐洲，我國新疆亦有分布。原植物羅馬除蟲菊為多年生草本，高15～45 cm，多具長柔毛，在春秋季采挖，洗凈，切斷，曬干[3]。其性味為三級末四級首干熱[3-4]，具有生干生熱，祛寒強筋，開通阻滯，祛風止痛，燥濕化痰，滋補神經等功效；在維吾爾醫中，主要用于白癜風、腫瘤、膝骨關節炎等疾病的治療[4-7]，尤其是在治療白癜風方面具有顯著的療效[8-9]。目前，對于阿納其根的化學成分研究甚少，并且含量測定尚未見報道。因此，本實驗室在對阿納其根進行物質基礎分析的過程中，發現阿納其根甲醇提取物中含有綠原酸類成分，而綠原酸又具有諸多生物活性，如抗氧化作用、抗癌作用、抗菌作用、抗病毒、保肝利膽、活血降壓等[10-16]，是目前天然產物領域研究的熱點之一[10-13]，現代科學對綠原酸的活性研究已深入到食品、醫藥、化妝品領域。且作為許多天然產物的活性成份，綠原酸在胃、小腸、大腸均有吸收且代謝廣泛[17-18]。故我們在此文首次提出了以綠原酸作為質量控制指標，建立阿納其根的質量標準。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀，包含PDA型紫外—可見檢測器，四元梯度泵(日本島津)。超聲波清洗器(型號：KH-250，昆山禾創超生儀器有限公司)。

1.1.2 試藥 綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，供高效液相法含量測定用，純度98%，批號：110753-201314)；乙腈(色譜純，sigma公司)；甲醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；阿納其根購自亳州市中正中藥材飲片有限公司，批號為130704。經北京中醫藥大學中藥學院譚鵬副教授鑒別為菊科植物羅馬除蟲菊(Anayccluspyerhturm.DC.)的根。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-18柱(5 μm；4.6 mm×150 mm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V);檢測波長：327 nm；流速:0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含48.4 μg的溶液，即得對照品溶液。所得HPLC圖譜。見圖1。

圖1 A：綠原酸的HPLC圖 B：200～400 nm范圍內的光譜

1.2.3 供試品溶液的制備 取阿納其根粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱定重量，超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，得供試品溶液。所得HPLC圖譜。見圖2。

圖2 A：阿納其根甲醇提取物的HPLC圖

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 標準曲線繪制 精密吸取綠原酸對照品2.5 mL(質量濃度為1.963 mg·mL-1)置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻。逐級稀釋，得質量濃度分別為0.968 mg·mL-1、0.3872 mg·mL-1、0.1936 mg·mL-1、0.0968 mg·mL-1、0.0484 mg·mL-1的對照品溶液，精密吸取上述各標準溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄其峰面積。以質量(X)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標，進行回歸，得回歸方程：Y=2296316.8X-1369.4(r=0.9999)。結果表明綠原酸在0.0484～0.968 mg按照實際的折算范圍內呈良好線性關系。

1.2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，每次吸取10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定峰面積，結果RSD=0.85%，結果表明，精密度良好。

1.2.4.3 穩定性試驗 精密稱取同一阿納其根樣品粉末0.5 g，按照“2.3”項下制備供試液，每次精密吸取10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h依次進樣，測定峰面積，記錄色譜圖，結果RSD%=1.11%，表明樣品在8 h內穩定。

1.2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一阿納其根樣品粉末6份，每份0.5 g，按供試品項下制備供試液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結果RSD=1.23%，阿納其根中綠原酸平均含量為0.11%，表明重復性良好。

1.2.4.5 回收率試驗 分別稱取已知含量(1.10 mg·g-1)的阿納其根樣品粉末6份，每份0.25 g，精密加入綠原酸對照品(0.3441 mg·mL-1)溶液0.5 mL，供試品項下制備，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件，記錄峰面積，計算得回收率如表1。

表1 阿納其根中綠原酸的加樣回收率(n=6)

表2 不同批次阿納其根藥材綠原酸含量測定

1.2.4.6 含量測定 精密吸取不同批次阿納其根藥材的供試液10 μL分別進樣，記錄峰面積，計算綠原酸的含量，結果見表2。由表2得出，不同批次阿納其根藥材綠原酸含量在0.095%～0.120%之間。

2 結果

2.1 檢測波長的選擇 選取200～400 nm的波長范圍，對濃度為48.4 μg/mL的綠原酸進行掃描，其最大吸收波長為324，考慮到檢測靈敏度等問題，固選取327 nm為本實驗的檢測波長。

2.2 流動相的選擇 采用了多種色譜流動相：1)甲醇-0.4%的磷酸水(10∶90)；2)甲醇-0.1%的甲酸水(10∶90)；3)乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)；經比較得出，采用乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)為流動相，得出的阿納其根中綠原酸的峰型及分離度等都較其他方法優，出峰時間亦較理想，所以采用乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)為色譜流動相。

2.3 綠原酸定量的方法 目前對于綠原酸含量測定的方法主要有：HPLC法[19-20,25]、薄層掃描法[21]、毛細管電泳法[22-25]等，而中藥具有多成分的特點，固選用HPLC法進行定量。經方法學考察表明，本實驗建立的方法簡便、準確、可重復性好，可作為阿納其根中綠原酸含量測定的方法。

3 討論

本課題在物質基礎研究過程中，首次發現阿納其根甲醇提物中含有綠原酸類化合物，并建立了其含量測定的方法。實驗考慮了波長，流動相等的選擇，發現在以乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V)為流動相，紫外檢測波長為327 nm時，綠原酸在質量為0.0484～0.968 mg范圍內呈良好線性關系。方法學考察發現，本法可以為維藥阿納其根的質量評價提供有效的方法和依據。

綠原酸類物質是植物中重要的次生代謝產物，分布在多種植物中，它是植物體內有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類產物，是多種植物的生物活性物質。在測定不同批次阿納其根含量的過程中發現，不同批次阿納其根中綠原酸含量有明顯差異，因此在以后的研究中，需結合藥效進行進一步研究，制定阿納其根真偽和優劣的標準，進一步保證臨床用藥的安全有效。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊[S].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社,1999:43-44.

[2]新疆維吾爾自治區衛生廳編.維吾爾藥材標準[S].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社,1993:143-144.

[3]顧永壽,顧永福.維吾爾醫常用藥材[M].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社,1992:22-23.

[4]古麗娜爾·卡斯木.阿納其根化學成分及其酪氨酸酶活性篩選研究[D].烏魯木齊:新疆醫科大學,2014.

[5]帕爾哈提爾·賽買提，玉蘇甫·買提努爾，熱甫開提·賽吾力丁，等.維藥阿那其根散劑外敷治療膝骨關節炎的臨床療效評價研究[J].中國民族醫藥雜志,2012,18(9):1-3.

[6]金小越,王智穎,郭世民.維藥阿那其根醇提物及原粉膠囊的急性毒性試驗[J].中國藥物經濟學,2013,3(9):31-32.

[7]熱娜古麗·阿布拉，買熱木·多力坤.關于治療白癜風的初探[J].中國民族醫藥雜志,2011,17(9):45-46.

[8]穆巴拉克,阿衣古麗.維吾爾醫治療白癜風介紹[A].中國民族醫藥學會.全國首屆侗醫藥學術研討會論文專輯[C].北京:中國民族醫藥學會,2004:3.

[9]古麗斯坦·阿吾提,何承輝,劉宣麟,等.復方驅蟲斑鳩菊丸質量標準[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(13):94-96.

[10]劉穎,郭明曄,白根本.綠原酸的研究進展[J].中藥材,2012,35(7):1180-1185.

[11]席利莎,木泰華,孫紅男.綠原酸類物質的國內外研究進展[J].核農學報,2014,28(2):292-301.

[12]Dos SMD，Almeida MC，Lopes NP，et al.Evaluation of the anti-inflammatory，analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid[J].Biol Pharm Bull，2006，29(11):2236-2240.

[13]席利莎,木泰華,孫紅男.綠原酸類物質的國內外研究進展[J].核農學報,2014,28(2):292-301.

[14]王輝,田呈瑞,馬守磊,等.綠原酸的研究進展[J].食品工業科技,2009,30(5):341-345.

[15]吳江濤.綠原酸的生物活性及其應用[J].現代農業科技,2009,2(19):349-350.

[16]劉穎,郭明曄,白根本.綠原酸的研究進展[J].中藥材,2012,35(7):1180-1185.

[17]高茹,林以寧,梁鴿,等.綠原酸的吸收與代謝研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(10):316-319.

[18]Olthof MR，Hollman PC，Katan MB.Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans[J].J Nutr，2001,131(1):66-71.

[19]李玉珍,肖懷秋.綠原酸分析測定方法研究新進展[J].江蘇調味副食品,2010,27(6):39-43.

[20]肖文平,李娟.金銀花中綠原酸的提取和含量測定[J].安徽農業科學,2011,39(35):21675-21676,21694.

[21]聶松柳,孟楣.薄層掃描法測定復方銀花口服液中綠原酸的含量[J].安徽醫藥,2010,14(10):1147-1149.

[22]張莉莉.金銀花中綠原酸的提取方法研究和毛細管電泳測定[D].長春:吉林大學,2006.

[23]顏流水,溫振東,黃智敏,等.毛細管電泳法測定金銀花中綠原酸、蘆丁和槲皮素[J].藥物分析雜志,2007,27(3):367-370.

[24]戴傳云,高曉燕,湯波,等.近紅外光譜法測定雙黃連口服液中綠原酸和連翹苷的含量[J].光譜學與光譜分析,2010,30(2):358-362.

[25]鐘方曉.高效液相及紫外分光光度法測定金銀花中綠原酸和異綠原酸含量方法學比較[J].時珍國醫國藥,2005,16(3):212-212.

(2015-09-20收稿 責任編輯：張文婷)

Method Study for Determination of Chlorogenic Acid in Anacyclus pyrethrum DC.of Uygur Medicine by RP-HPLC

Dong Jie，Ji Jiaojiao，Wang Jiali，Yuan Jiang，Wang Beibei,Zhao Shuang,Zheng Zunshan，Liu Yonggang

(SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China)

Objective:A high performance liquid chromatography method(HPLC)was established to determine chlorogenic acid in the root of Anaycclus pyerhturm.DC.Methods:HPLC ana1ysis was actualized on an Agilent 5 TC-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)column with mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution(13∶87，V/V)，flow rate was 0.8 mL·min-1，detection wavelength was 327 nm.Results:The calibration curve was a good linear with a range of 0.0484～0.968 mg·for chlorogenic acid(Y=2296316.8X-1369.4，r=0.9999).The average recovery rate for chlorogenic acid was 100.20%，RSD=2.75%.Conclusion:This method is simple，sensitive，reproducible，which is suitable for the quality control of the root of Anaycclus pyerhturm.DC.

Uygur Medicine; Anaycclus pyerhturm.DC.; HPLC; Chlorogenic acid; Content determination

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(編號：201318101-5)

劉永剛(1981.02—)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質基礎研究，E-mail：liuyg0228@163.com

R29；R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.067