苦酸通調方對自發性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達的影響※

●米 佳高勝男 朱浩宇 陳 曦 樸春麗

苦酸通調方對自發性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達的影響※

●米 佳*高勝男 朱浩宇 陳 曦 樸春麗▲

目的：觀察苦酸通調方對自發性糖尿病大鼠腹部脂肪中脂肪酸生成酶(FAS)蛋白表達的影響。方法：將高脂飼料喂養的雄性SPF級ZDF(Zucker Diabetic Fatty )大鼠隨機分為模型組、苦酸通調組、吡格列酮組，普通飼料喂養的雄性SPF級ZL(Zucker Lean)大鼠為正常對照組，每組各10只。苦酸通調組按照3.29g·kg-1灌胃給藥，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥，模型組、正常對照組予等體積蒸餾水灌胃，連續12周。經Western blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達情況。結果：與正常組比較，模型組FAS蛋白表達明顯升高(P<0.05)；苦酸通調方組及吡格列酮組可明顯降低FAS蛋白表達，與模型組比較有明顯改善(P<0.01)。結論：苦酸通調方可明顯降低糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達。

苦酸通調方 2型糖尿病 胰島素抵抗 脂肪酸合成酶

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂綜合征[1]。隨著生活方式的改變，生活水平的提高，糖尿病以其較高的發病率成為嚴重影響人類健康的問題。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病的兩個基本環節[2]。脂肪酸合成酶(FAS)是膽固醇及脂肪酸合成途徑中的關鍵酶之一，在脂肪酸和甘油三酯代謝中發揮著重要作用[3]，是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成內源性長鏈脂肪酸的關鍵酶[4]。其表達的改變可能是肥胖、2型糖尿病發生的分子基礎之一。本實驗研究苦酸通調方對ZDF大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達情況的影響，進一步研究本方的可能機制。

1 材料

1.1 藥物 苦酸通調方(由黃連、烏梅、大黃、干姜4味中藥組成，由長春中醫藥大學附屬醫院顆粒藥房提供)；吡格列酮(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：國藥準字H20040631)。

1.2 動物 SPF級9周齡雄性ZDF大鼠，體重(244～291)g；SPF級9周齡雄性ZL大鼠，體重(183～220)g，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證：SCXK(京)2014-0003。大鼠在北京中醫藥大學基礎醫學院實驗室中飼養，實驗室溫度20～22℃，相對濕度(55±5)%，12/12小時光照黑暗循環。適應環境1周后開始實驗。

1.3 試劑 FAS(批號：PW2-3)、抗體(批號：3777R-100)、Anti-FAS(批號： CA1101)、Anti-GAPDH(批號：25007)均購自美國CST公司；蛋白裂解液+苯甲基磺酰氟(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0006)均購自上海碧云天生物技術公司。

1.4 儀器 調節臺式高速低溫離心機(HERAEUS Fresco 17，Thenno Scientific，USA)；溫控震蕩儀(Thenno Scientific，USA)；電泳儀、電泳及電轉移裝置(PowerPac Basic，Bio-Rad，USA)；酶標儀(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad ，USA)；凝膠圖像處理系統(Tanon GIS-1000，上海)。

2 方法

2.1 自發性肥胖2型糖尿病大鼠模型制備 ZDF大鼠予普通飼料適應性喂養1周后，予高脂飼料#5008[購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0008，粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%]喂養。大鼠定期行糖耐量實驗，試驗前禁食不禁水15h，剪尾取血，微量血糖儀測空腹血糖后，予30%葡萄糖溶液按2g·kg-1灌胃[5]。糖負荷后分別在0.5h、1h、1.5h和2h剪尾取血，用血糖儀測量血糖。當血糖峰值高于16.7mmol·L-1和/或糖負荷后2h高于11.1mmol·L-1時，可診斷為糖尿病或糖耐量減低，表明造模成功。

2.2 分組及給藥 將造模成功的ZDF大鼠30只隨機分為模型組、苦酸通調組、吡格列酮組各10只；10只ZL大鼠為正常對照組。苦酸通調方組按照3.29g·kg-1(前期工作已確定的最佳劑量)混懸液灌胃給藥[6]；吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥；正常對照組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續灌胃12周，每日1次。給藥期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其他組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱重，根據體重調整灌胃劑量。2.3 標本采集、制備 給藥12周后，將大鼠處死后打開腹腔，迅速取出腹部脂肪組織，把組織剪切成細小的碎片，PMSF與PIPA裂解緩沖液以1：100的比例加入組織中，渦旋振蕩，冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，將勻漿液其置于EP管中，4℃、13000rpm·min-1離心30min，收集中層清液，用于檢測FAS蛋白的表達。

2.4 Western blot法檢測腹部脂肪組織FAS蛋白的表達 裂解脂肪細胞并勻漿，離心取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取樣品5μL，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，Anti-FAS、Anti-GAPDH抗體稀釋液與膜充分接觸，4℃過夜，TBST中室溫脫色，放入二抗稀釋液，封閉，37℃孵育1h，顯影曝光、洗片，掃描儀掃描電泳調帶，軟件進行光密度值分析。

3 結果

在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、苦酸通調組大鼠腹腔脂肪組織中FAS蛋白的表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)；苦酸通調組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)，說明苦酸通調方和吡格列酮均能降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織FAS蛋白的表達水平，且苦酸通調組降低幅度大于吡格列酮組(P<0.05)。見表1、圖1。

分組FAS正常對照組0.54±0.03模型組0.96±0.02*吡格列酮組0.74±0.01*△苦酸通調組0.67±0.02*△#

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與吡格列酮組比較，#P<0.05。

圖1 各組大鼠脂肪組織中FAS蛋白的表達(Western blot條帶圖)

4 討論

由于人們生活方式改變和體力活動缺乏的現狀，在中國DM的患病率逐年增加，是繼腫瘤、心血管疾病之后世界第三大威脅人類健康的疾病。本課題組所在團隊經十余年的臨床和動物實驗研究[7，8]證實，六郁和絡滯并存是導致肥胖2型糖尿病的核心病機。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡脈。絡滯是由六郁交互作用而形成絡脈郁滯的病理狀態。苦酸通調方是以四氣五味藥性理論設立苦酸通調法，以苦味藥為主，與酸味藥相配合，由《溫病條辨》所記載的連梅湯(黃連、烏梅)加大黃、干姜而成。苦酸通調方按照君臣佐使的組方原則進行藥物配伍，以“六郁和絡滯”的病機理論為基礎，治療以清熱瀉火，養陰生津，解毒通絡為原則，以苦酸通調為治療大法。既往臨床研究發現[9]，苦酸通調方對肥胖2型糖尿病胰島素抵抗患者有較好的改善作用。

實驗結果表明，與空白對照組相比，糖尿病模型組大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白表達量顯著上調，苦酸通調方組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中FAS蛋白的表達，這可能是苦酸通調方抑制脂肪信號通路的傳導而發揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。這為我們以后開展中藥復方有效物質的研究提供了思路。

[1]陳艷芬，王春怡，李衛民，等.黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應激和NF-KB表達的影響[J].中成藥，2012，34 (8)：1428-1432．

[2]Lanuza-Masdeu J，Arévalo mI，Vila C，et al.In vivo JNK activation in pancreatic β-cells leads to glucose intolerance caused by insulin resistance in pancreas[J].Diabetes，2013，62(7)：2308-2317.

[3]Menendez J A.Vazquez Martin A，Ortega F J，Femandez Real JM.Fatty acid synthase.Association with insulin resistance，type 2 diabetes and cancer[J].Clin Chem，2009，55(3)：425-38.

[4]ChoiW J，Jeon B N，Park H，et al.Proto oncogene FBI-1(Pokemon) and SREBP-1 synergistically activate transcription of fattyacid synthase gene(FASN)[J].Chin Phamacol Bull，2006，22(7)：780-784.

[5]Pick A，Clark J，Kubstrup C，et al．Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat [J]．Diabetes，1998，47(3)：358-64.

[6]樸春麗，陳 曦，于 敏，等.消渴脂平干預自發Ⅱ型糖尿病大鼠炎癥及脂代謝的實驗研究[J].吉林中醫藥，2011，31(4)：379.

[7]王淑俊，樸春麗，劉禹辛.苦酸通調I號方治療肥胖型2型糖尿病40例臨床觀察[J].中華實用中西醫雜志，2009，22(4)：221-222.

[8]樸春麗，鄧 悅，米 佳.苦酸通調法抑制糖尿病脂肪組織炎癥機制的理論探討[J].中華實用中西醫雜志，2009，22(3)：146-148.

[9]樸春麗，陳 曦，米 佳.苦酸通調法治療糖尿病前期的臨床研究[J].中外健康文摘，2012，9(44)：128.

吉林省自然科學基金項目(No.201115169)

米佳，女，醫學博士，主治醫師。研究方向：中醫藥治療內分泌及代謝病的研究。

▲通訊作者 樸春麗，女，醫學博士后，主任醫師，教授，博士研究生導師。研究方向：中醫藥治療內分泌及代謝病的研究。E-mail：pcl2013@sina.cn

長春中醫藥大學附屬醫院(130021)