Eaf2基因敲除對紫外線誘導的鼠白內障形成的影響

姜艷華，張勁松

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Eaf2基因敲除對紫外線誘導的鼠白內障形成的影響

姜艷華，張勁松

Effects of Eaf2 gene knockout on cataract induced by ultraviolet irradiation in mice

Yan-Hua Jiang，Jin-Song Zhang

Citation:Jiang YH, Zhang JS.Effects of Eaf2 gene knockout on cataract induced by ultraviolet irradiation in mice.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):228-230

摘要

目的：分析Eaf2基因敲除對紫外線誘導的小鼠白內障形成的影響。

方法：將15只野生型(WT)小鼠作為對照組，10只Eaf2基因敲除(Eaf2 KO)小鼠作為實驗組。兩組均取14周齡左右的小鼠作為研究對象。進一步分組為：WT-nonUV、WT-UV、Eaf2 KO-nonUV、Eaf2 KO-UV，共4組。使用裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內障程度，利用晶狀體混濁分類系統Ⅱ(LOCSⅡ)對小鼠白內障進行分級。然后斷頸處死小鼠，摘取晶狀體進行暗視野顯微鏡照相，利用Image J軟件對晶狀體混濁程度進行分析，并將各測量結果進行統計學處理。

結果：裂隙燈顯微鏡和暗視野顯微鏡的結果一致：WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統計學差異(P<0.05)。

結論：紫外線輻射能夠導致小鼠白內障的形成，Eaf2蛋白質具有促進紫外線所致的小鼠白內障形成的作用。

關鍵詞：Eaf2；基因敲除；白內障；晶狀體上皮細胞；紫外線

引用：姜艷華，張勁松.Eaf2基因敲除對紫外線誘導的鼠白內障形成的影響.國際眼科雜志2016;16(2):228-230

0 引言

白內障是晶狀體透明度降低或者顏色改變所導致的視覺障礙[1]，目前已成為世界范圍內主要的致盲眼病[2-3]。波長為290~320nm的中波紫外線可以穿過角膜、房水被晶狀體吸收，這促進了年齡相關性白內障的形成[4-5]。晶狀體上皮細胞主要位于晶狀體前囊下，在保護整個晶狀體的透明度和內環境穩定上起著不可或缺的重要作用[3]。對晶狀體上皮細胞的非程序DNA合成進行測定，結果提示白內障是繼發于晶狀體上皮細胞DNA損傷后未修復或錯誤修復的結果[6]。Eaf2為一個潛在的腫瘤抑制因子，能夠與ELL(Elevennineteen Lysine-rich Leukemia)相互作用增強RNA聚合酶Ⅱ的活性而發揮轉錄調節的作用[7-8]。已有研究表明，Eaf2能夠參與眼睛的發育，并提示Eaf2在調控晶狀體發育和成熟中發揮重要功能[9]。有研究證實，Eaf2蛋白質對紫外線誘導的晶狀體上皮細胞凋亡具有促進作用[10]，我們提出疑問：Eaf2基因敲除對紫外線誘導的小鼠白內障的形成是否存在影響呢？

表1　各組小鼠晶狀體混濁程度分級情況眼

圖1裂隙燈顯微鏡照相結果A：WT-UV組；B：Eaf2 KO-UV組；C：WT-nonUV組；D：Eaf2 KO-nonUV組。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品復方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥株式會社)。

1.1.2實驗動物實驗用Eaf2基因敲除小鼠和對照小鼠由中國醫科大學附屬第四醫院眼科晶狀體實驗室提供，基因敲除鼠和對照鼠均由Bm12小鼠構建，按照ARVO聲明飼養。

1.1.3主要儀器紫外線燈(Spectroline XX-15N/F，Spectronice Corporation)；紫外線能量測試儀(UVX Radiometer，UVP)；裂隙燈顯微鏡(Topcon，日本)；暗視野顯微鏡(Olympus BX40，日本)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及飼養將15只野生型(WT)小鼠作為對照組，10只Eaf2基因敲除(Eaf2 K.O.)小鼠作為實驗組。兩組均取14周齡左右的小鼠作為研究對象。按照ARVO聲明飼養小鼠，定時觀察小鼠精神、飲食和排便等情況。紫外線照射第3wk，WT-UV組有一只小鼠角膜混濁，無法觀察晶狀體混濁情況，剔除實驗。因此進一步分組為：WT-UV(14眼)為A組，Eaf2 KO-UV(10眼)為B組，WT-nonUV(15眼)為C組，Eaf2 KO-nonUV(10眼)為D組，共4組。

1.2.2紫外線輻射晶狀體紫外線照射前，裂隙燈檢查所有小鼠，剔除已經患有白內障的小鼠。實驗所用紫外線波長為302nm，強度為200W/cm2，將紫外透射光源用錫箔紙覆蓋，只留有一個直徑5mm的小孔。紫外線照射時，不對小鼠進行麻醉，直接照射。只對每只小鼠的右眼進行照射，左眼作為對照，不進行紫外線的照射。于紫外線照射前5min，對每只小鼠的右眼進行復方托吡卡胺散瞳。紫外線照射每周進行兩次，每次持續100s，共照射3wk(總共1200mJ/cm2)，最后一次照射48h后，裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度。利用晶狀體混濁分類系統Ⅱ(lens opacities classification system Ⅱ，LOCS Ⅱ)對晶狀體混濁程度進行分級：晶狀體皮質完全透明為0級；少量點狀混濁為1級；點狀混濁擴大，瞳孔區出現少量點狀混濁為2級；車輪狀混濁，超過兩個象限為3級；車輪狀混濁擴大，瞳孔區約50%的混濁為4級；瞳孔區90%的混濁為5級。然后斷頸處死小鼠摘取晶狀體以進行暗視野顯微鏡照相，根據所拍攝的圖像，利用Image J軟件對白內障區域比例進行分析，白內障區域比例(cataract area ratio)=白內障區域面積/前囊膜(anterior capsules)區域面積。

統計學分析：應用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗對不同組別的裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度分級和暗視野顯微鏡拍照的白內障面積比例進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內障的形成裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體混濁程度的小鼠眼球前節照相：A組和B組晶狀體均可見明顯晶狀體皮質混濁，C組和D組可見少量點狀晶狀體皮質混濁。根據LOCS Ⅱ對晶狀體混濁程度進行分級，A圖為4級，B圖為3級，C圖及D圖為1級(圖1)。所有樣本進行秩和檢驗，統計結果為：WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統計學差異(χ2=11.31，P<0.05，表1)。

2.2暗視野顯微鏡觀察小鼠白內障的形成暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁面積：圖中可見A組和B組晶狀體可見明顯晶狀體皮質混濁，C組和D組未見明顯晶狀體皮質混濁(圖2)，其中圖A中白內障的面積占整個前囊膜面積比例的59.2%，B圖為25.4%，C圖為0%，D圖為0%。WT-UV組及Eaf2 KO-UV組晶狀體混濁面積明顯高于WT-nonUV組及Eaf2 KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2 KO-UV組，均具有統計學差異(χ2=12.84，P<0.05)。

3 討論

胚鼠和成熟鼠體內均可發現Eaf2的表達[11-12]，利用基因重組和雜交技術人們構建了Eaf2基因敲除小鼠[12]，以便于進行Eaf2基因調控和蛋白質功能的研究。雖然Eaf2被認為是一種重要的腫瘤抑制物，但研究顯示在生后4mo內，該基因敲除小鼠和其野生型之間的生存率是沒有差異的，而且直到24mo基因敲除鼠組內未見明顯的機體異常表現。國內目前尚未有對小鼠Eaf2基因的研究，國外的研究主要集中在腫瘤組織的分子生物學方面的研究。雖然基因敲除小鼠在6~12mo沒有觀察到腫瘤的發生，但卻出現了心肌細胞和前列腺上皮細胞的肥大和增生，這表明作為腫瘤抑制劑的Eaf2有調節細胞增殖和形態的功能；同時在18~24mo的Eaf2純合子和雜合子個體出現了自然發生的腫瘤，這包括：肺腺癌、B細胞淋巴瘤、肝癌和前列腺上皮內瘤樣增生。在該模型中Eaf2敲除的致癌作用是緩慢的，肉眼可見的腫瘤多發生在較年長的動物個體內。因此Eaf2基因敲除小鼠的腫瘤發生近似于大多數人類腫瘤的形成，為這些類型腫瘤的治療方法研究提供了動物模型基礎[12]。

圖2暗視野顯微鏡照相結果A：WT-UV組；B：Eaf2 KO-UV組；C：WT-nonUV組；D：Eaf2 KO-nonUV組。

自然界中的紫外線可分為波長為200~280nm的短波紫外線、280~320nm的中波紫外線和320~400nm的長波紫外線，本實驗使用波長為302nm的中波紫外線成功建立了紫外線誘導的小鼠白內障模型。紫外線導致晶狀體上皮細胞損傷，并誘發細胞凋亡，細胞脫落、移行，使細胞密度降低，影響晶狀體纖維的生長和生長質量，并導致晶狀體纖維滲透壓失衡，其完整性和透明性受損[13]。白內障是各種原因造成晶狀體蛋白變性致使晶狀體混濁，與晶狀體上皮細胞生理機能和病理改變有密切關系，目前認為晶狀體上皮細胞凋亡是各種非先天性白內障形成的共同細胞學基礎。我們的實驗中，Eaf2基因敲除的小鼠白內障的嚴重程度明顯較野生組減低，其可能的作用機制是Eaf2蛋白對紫外線誘導的晶狀體上皮細胞的凋亡具有促進作用，也有研究顯示，Eaf2很可能在某種條件下與p53存在相互作用，并影響p53的轉錄活性[14]。Eaf2蛋白也許可以提高晶狀體上皮細胞對于紫外線輻射損傷的敏感度，使異常的細胞及早被發現，并通過凋亡機制將其清除，以保證晶狀體的功能不被這些異常細胞所干擾。從這一角度來說，Eaf2蛋白在維持晶狀體上皮細胞“新陳代謝”方面具有積極的意義。但是過度紫外線輻射可能會導致廣泛的晶狀體上皮細胞凋亡進而誘發白內障的發生。紫外線誘導晶狀體上皮細胞凋亡在白內障的發生、發展中起著重要作用。目前白內障的主要治療手段仍是手術摘除+人工晶狀體植入，缺乏有效的藥物治療方法。由白內障導致的視力障礙以及手術治療所需的高額費用，給患者、家庭以及社會都帶來了巨大的壓力和負擔。盡管前人已對白內障進行了大量的研究，但人們對白內障的發病機制仍未達成完全共識，目前晶狀體上皮細胞的凋亡及DNA損傷修復成為了白內障的研究熱點，因此阻斷晶狀體上皮細胞的凋亡途徑，提高晶狀體上皮細胞DNA損傷后的修復能力，將給白內障的預防及治療帶來新的希望。從細胞凋亡角度出發，通過Eaf2基因敲除小鼠模型對白內障的發病機制進一步深入研究，并據此開發新的、經濟有效的藥物治療方法，通過藥物抑制晶狀體上皮細胞凋亡而達到預防白內障的目的，將對提高患者生活質量，減輕患者精神和經濟負擔，促進社會醫療資源的優化和合理配置起到巨大作用。

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·實驗研究·

Foundation item:the National Natural Science Foundation of China(No.81270988)

Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, the Eye Hospital of China Medical University, the Key Laboratory of Lens Research of Liaoning Province, Shenyang 110005, Liaoning Province, China

Correspondence to:Jin-Song Zhang. Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, the Eye Hospital of China Medical University, the Key Laboratory of Lens Research of Liaoning Province, Shenyang 110005, Liaoning Province, China. cmu4h-zjs@126.com

Received：2015-07-09Accepted：2016-01-18

Abstract

?AIM:To evaluate the effects of Eaf2 gene knockout on cataract in mice induced by ultraviolet irradiation.

?METHODS:Fifteen wild type mice were used as the control group, and 10 Eaf2 KO mice were used as the experimental group. The 14-week mice were taken as the research objects in the two groups. So the subgroups were: WT -nonUV, WT -UV, Eaf2 KO-nonUV and Eaf2 KO-UV, a total of 4 groups. Observe the lens of miceinvivowith slit lamp microscope, grade the lens opacity with Lens Opacities Classification System II (LOCSII). Then the mice were sacrificed by breaking the neck, the lens were removed and were observed by dark field microscopy. According to the captured images, the proportion of cataract region was analyzed using Image J software. The data of the two groups were statistically analyzed.

?RESULTS: The results detected by the two methods were similar. In WT-UV group and Eaf2 KO-UV group, the degree of lens opacity was significantly higher than those of WT-nonUV group and Eaf2 KO-nonUV group. The lens opacity of WT-UV group was significantly higher than that in Eaf2 KO-UV group, and the difference was statistically significant (P<0.05).

?CONCLUSION: Ultraviolet radiation can lead to the formation of cataract in mice. Eaf2 protein can promote the formation of cataract in mice caused by ultraviolet.

KEYWORDS:?Eaf2; gene knockout; cataract; lens epithelial; ultraviolet

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.07

收稿日期：2015-07-09 修回日期： 2016-01-18

通訊作者：張勁松，教授，博士研究生導師，遼寧省醫學會眼科分會主任委員，研究方向：白內障的基礎與臨床.cmu4h-zjs@126.com

作者簡介：姜艷華，在讀博士研究生，主治醫師，研究方向：白內障。

基金項目：作者單位：(110005)中國遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬第四醫院眼科 中國醫科大學眼科醫院 遼寧省晶狀體學重點實驗室