HSP70—1基因多態性與2型糖尿病易感性關系研究

楊毅+楊陽

[摘要] 目的 探討HSP70-1（+190G/C）基因多態性與2型糖尿病易感性關系。 方法 收集2013年1月～2015年1月在河南省上蔡縣人民醫院內分泌科住院及健康體檢的人群資料，依照納入與排除標準，確定研究對象共480例，其中2型糖尿病患者（病例組）240例，男132例，女108例；健康人群（對照組）240例，男124例，女116例。對研究對象進行問卷調查、體格檢查和實驗室指標的測定，并采用PCR-RFLP技術檢測HSP70-1基因+190位點多態性。 結果 2型糖尿病病例組和對照組的HSP70-1各基因型及等位基因頻率差異無統計學意義（χ2=1.386，P>0.05；χ2=1.260，P>0.05）；C/C基因型攜帶者的體質指數明顯高于G/G基因型攜帶者，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 HSP70-1基因+190位點基因多態性可能與糖尿病易感性無關；C/C基因型增加了攜帶者患肥胖病的風險。

[關鍵詞] 2型糖尿病；熱應激蛋白70-1；+190位點；基因多態性

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）26-0001-03

Heat stress protein 70-1 gene polymorphisms and the risk of type 2 diabetes

YANG Yi1 YANG Yang2

1.Department of Emergency， People's Hospital of Shangcai County in Henan Province， Shangcai 463800， China； 2.Department of Nosocomial Infection， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China

[Abstract] Objective To explore the association between HSP70-1 gene polymorphisms and type 2 diabetes. Methods According to the inclusion and exclusion criteria， a total of 480 population who received medical health examination and patients with type 2 diabetes in people's hospital of Shangcai from January 2013 to January 2015 were enrolled in the study. 240 patients were identified as a case group， including 108 women and 132 men， randomly selected 240 healthy people as a control group with 124 men and 116 women. Data was analyzed by physical examination， questionnaire and laboratory examination， and polymerasechain reaction-restrained fragment length polymorphism technique was used to analysed the polymorphisms of HSP70-1+190. Results There was no significant difference in the distribution of allele and genotypes frequencies of HSP70-1 between the type 2 diabetic group and control group （χ2=1.386，P>0.05； χ2=1.260， P>0.05）； CC carriers had a higher level of BMI than GG carriers in HSP70-1 gene（P<0.05）. Conclusion There is no significant correlation between HSP70-1+190 and type 2 diabetes；C/C genotype of HSP70-1（+190） is related to obesity，CC carrier had increased the susceptibility of obesity.

[Key words] Type 2 diabetes； Heat shock protein 70-1 gene； +190 site； Gene polymorphism

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是由多種病因引起的內分泌代謝紊亂疾病， 其特點是胰島素相對或絕對分泌不足及其周圍組織發生胰島素抵抗，可造成蛋白質、脂肪、碳水化合物代謝紊亂，導致各種器官發生慢性損傷及功能障礙衰竭[1]。有較多數據表明[2]，糖尿病可能與遺傳因子的易感性有關，糖尿病易感性與相關候選基因多態性關系已成為目前研究的熱點。熱休克蛋白70（heat shock protein 70， HSP70）是指機體細胞在高溫下或受到其他有害因素刺激時，適應性合成的一類結構上高度保守的多肽，它能幫助恢復細胞的結構與功能，并提高對應激因素的抵抗力[3]。有研究報道[4]，HSP70家族基因多態性與一些疾病的易感性密切相關，HSP70基因多態性可能是2型糖尿病發病的重要機制之一。因此，本研究觀察并分析HSP70家族中HSP70-1基因多態性，探討2型糖尿病是否與HSP70-1（+190G/C）基因多態性有關，為尋找人群易感生物標志物提供一定的思路和線索，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例-對照研究方法，依照納入與排除標準，選取2013年1月～2015年1月在河南省上蔡縣人民醫院內分泌科及門診健康體檢的人群資料共480例作為研究對象。2型糖尿病患者（病例組）240例，男132例，女108例，平均年齡（56.9±7.6）歲；健康人群（對照組）240例，男124例，女116例，平均年齡（55.1±7.1）歲。

1.2 診斷標準

依照WHO1999年制訂的DM新的診斷標準[5]：糖尿病癥狀+空腹血漿血糖（FBG）≥7.0 mmol/L或餐后2 h隨機血漿血糖≥11.1 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗中，2 h血漿葡萄糖水平（P2BG）≥11.1 mmol/L。研究對象的籍貫均為河南省，且相互之間無血緣關系，并排除患有精神疾病、惡性腫瘤及拒絕配合等調查者的人群資料。

1.3 方法

1.3.1 一般情況及生化指標檢測 對調查對象進行問卷調查、體格檢查和實驗室指標的測定。通過問卷了解研究對象的一般情況，如性別、年齡、民族、疾病史、家族史等。體格檢查主要是進行身高、體重、血壓、腰圍、臀圍等指標檢測，并分析腰臀比值（WHR）和體質指數（BMI）。生化指標檢測內容：收集調查對象的血液樣本，進行空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HbA1C）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等。

1.3.2 HSP70-1基因多態性的檢測 采用PCR-RFLP技術測定HSP70-1（+190G/C）基因多態性。以抽提全血中DNA為模板，進行目的基因擴增，擴增目的片段為325bp。PCR擴增反應引物序列：上游引物：5- TCCGGCGTCCGGAAGGACC-3；下游引物：5- TGCGGCCAATCAGGCGCTT-3。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min→95℃變性35 s→58℃退火35 s→72℃延伸45 s，上述步驟共循環35次，最后72℃延伸10 min。然后取PCR擴增產物10 μL，加入限制性內切酶（BsrBⅠ）進行酶切反應，根據目的蛋白分子量用3%瓊脂糖配置凝膠，在膠孔中加入8 μL酶切產物，于100 V恒壓下電泳25～30 min。在凝膠成像系統下觀察電泳結果，酶切反應后G/G基因型酶切片段為171、70、84 bp，C/C基因型酶切片段為241、84 bp，G/C基因型酶切片段為241、70、84、171 bp。

1.3.3 等位基因頻率計算 假設G/G基因型、G/C基因型、C/C基因型個數分別為a、b、c，基因型個數為N，基因型頻率分別為A、B、C。則A=a/N；B=b/N；C=c/N。G基因頻率=A+2/B；C基因頻率=C+2/B。

1.4 統計學分析

Epidata 3.2軟件錄入數據，統計數據的分析使用SPSS19.0軟件。直接計數法計算各基因型的頻率，依據遺傳平衡定律的二項式公式分析各等位基因頻率；采用RxC的χ2檢驗分析各組基因型及等位基因頻率分布情況；多組間的比較采用單因素的方差分析。取檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組研究對象一般情況比較

由表1可見，與對照組相比，病例組的FPG、P2BG、HbA1C、BMI、SBP、DBP、TG和LDL-C水平明顯增高，而HDL-C水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。兩組性別、年齡、WHR和TC水平差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 病例組和對照組一般情況比較（x±s，n=240）

注：與對照組比較，（1）P<0.05

2.2 HSP70-1基因+190位點PCR擴增和酶切產物電泳結果

HSP70-1基因+190位點的PCR擴增后，片段長度為325 bp，見封三圖1中1～6游道。HSP70-1的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳后可見C/C基因型為241、84 bp 2個片段（第1泳道），G/G基因型攜帶者為70、84、171 bp 3個片段（第2泳道），G/C基因型為241、70、84、171 bp 4個片段（第3泳道）。見封三圖2。

2.3 HSP70-1基因各個基因型及等位基因頻率的比較

HSP70-1基因+190位點基因型頻率在病例組和對照組中分布差異無統計學意義（χ2=1.386，P>0.05）；病例組與對照組的等位基因頻率分布差異無統計學意義（χ2=1.260，P>0.05）。見表2。

2.4 HSP70-1基因+190位點不同基因型間的臨床資料比較

在本次調查對象中，G/G基因型的攜帶者為260例，G/C基因型的攜帶者為187例，C/C基因型的攜帶者為26例。由表3可見，在BMI水平上，+190位點的不同基因型間差異有統計學意義（P<0.05），而不同基因型間的其他臨床指標差異無統計學意義（P>0.05）。通過組間兩兩比較，結果發現，與G/G基因攜帶者相比，C/C基因型攜帶者的BMI水平明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）。

表3 HSP70-1基因+190位點不同基因型間的臨床資料比較（x±s）

注：與G/G基因型比較，（1）P<0.05

3 討論

熱休克蛋白又稱為熱應激蛋白[6]，機體細胞在高溫下或受到其他有害因素刺激時，會適應性合成的一類結構上高度保守的多肽，其中最為重要、誘導產生最強的是熱應激蛋白70。人類HSP70基因定位于多條染色體上[7，8]，其中HSP70-1、HSP70-2、HSP70-hom共同編碼分子量從66kD-78kD一類具有高度相關性的蛋白質。有學者研究報道[9，10]，HSP70基因多態性可能在2型糖尿病及其微血管病變的發病過程中起到重要作用。目前國內研究中，有關2型糖尿病易感性與HSP70基因多態性關系尚缺乏較為完善的臨床證據。因此，本研究以內分泌科2型糖尿病患者和體檢人群為調查對象，觀察2型糖尿病患者與正常人群的HSP70-1基因+190位點基因多態性的分布差異，以探討HSP70-1基因+190位點基因多態性與2型糖尿病易感性關系。

有學者研究證實[11]，HSP70-1基因-110位點和+190位點多態性均與2型糖尿病腎病相關，而其是否與2型糖尿病有關尚不明確。本次研究結果發現，HSP70-1（+190G/C）的各基因型和等位基因頻率在2型糖尿病組與對照組中的分布差異無統計學意義，提示HSP70-1基因+190多態性可能與2型糖尿病易感性無關。通過genebank檢索報道，HSP70-1基因在120、190、438和-110等位點具有多態性，以上位點是否與2糖尿病易感性有關有待進一步證實。

以往有學者研究報道[12]，HSP70-1基因+190位點多態性可能與噪聲性耳聾、高原性反應、多環芳烴類化合物等有關，考慮可能由于190位點存在G→C的突變，引起HSP70-1肽結構的改變，使之無法完成分子伴侶的功能，從而機體不能生成或轉運相應蛋白以抵抗應激，故C/C基因型可能與某些疾病易感性相關[13-15]。本研究分析了HSP70-1（+190G/C）的不同基因型攜帶者間臨床指標水平，結果顯示，與G/G基因攜帶者相比，C/C基因型攜帶者的BMI水平明顯增高，差異有統計學意義。BMI是常用的衡量肥胖的依據，其是反應全身性性肥胖的一個較好依據。本次研究結果提示，HSP70-1基因的C/C基因型可能與全身性肥胖關系密切，其可能明顯升高了攜帶者患肥胖病的風險。

綜上所述，HSP70-1基因+190位點多態性與本次研究人群的2型糖尿病易感性無關。然而，C/C基因型可能與肥胖相關，其增加了攜帶者患全身性肥胖的風險。熱休克蛋白70作為一個多基因家族，其在生物進化中可能同時存在遺傳和變異，而HSP70-1、HSP70-2和HSP70-hom等基因位點多態性是否與2型糖尿病及其相關指標有關，尚需大量研究加以證實，以期為尋找糖尿病及其相關疾病易感生物標志物提供線索。

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（收稿日期：2015-06-04）