肝細胞癌Adv—p53、AAV—HGFK1聯(lián)合轉基因治療的臨床療效和預后分析

張法標+方哲平

[摘要] 目的 分析肝細胞癌Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合轉基因治療的臨床療效和預后。 方法 選取我科2009年1月～2012年1月進展期肝癌患者共50例，隨機分為重組腺相關病毒-肝細胞生長因子第l螺旋區(qū)（recombinant adeno-associated virus-kringle 1 domain of hepatocyte growth factor）AAV-HGFK1+Adv-p53組和AAV-HGFKI組。比較兩組患者治療后肝穿刺活檢標本新生微血管和凋亡細胞率、臨床療效、復發(fā)率、生存率。 結果 AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細胞率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.01）。AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為84.00%，顯著高于AAV-HGFK1組48.00%（P<0.05）；兩組患者的疾病緩解率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年、3年生存率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.05）。 結論 Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合治療進展期肝細胞癌療效優(yōu)于AAV-HGFK1單獨治療，預后更佳。

[關鍵詞] Adv-p53；AAV-HGFK1；轉基因治療；肝細胞癌；預后

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）26-0008-04

Clinical efficacy and prognosis of Adv-p53， AAV-HGFK1 combined gene therapy for HCC

ZHANG Fabiao FANG Zheping

Department of Hepatobiliary Surgery， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To analyze the clinical efficacy and prognosis of Adv-p53， AAV-HGFK1 combined gene therapy for HCC. Methods Fifty patients with advanced liver cancer in our department from January 2009 to January 2012 were randomly divided into AAV-HGFK1+Adv-p53 group and AAV-HGFK1 group. The liver biopsy specimens microvessel and apoptosis rate， clinical efficacy and relapse rate were compared in two groups of patients. Results The number of microvessels in AAV-HGFK1+Adv-p53 group 14 days and 21 days was significantly lower than AAV-HGFKI group. The apoptosis rate was significantly higher than that of AAV-HGFK1 group（P<0.01）. The disease control rate in AAV-HGFK1+Adv-p53 group was 84.00%， which was significantly higher than 48.00% in the AAV-HGFK1 group（P<0.05）. The remission of the disease in patients had no significant difference between the two groups（P>0.05）. The 1，3-year recurrence rate in the AAV-HGFK1+Adv-p53 group was significantly lower than AAV-HGFK1 group， the 1，3-year survival rate was significantly higher than that of AAV-HGFK1 group（P<0.05）. Conclusion Adv-p53， AAV-HGFK1 combination therapy for advanced hepatocellular carcinoma is more effective than AAV-HGFK1 alone treatment， while the prognosis is better.

[Key words] Adv-p53； AAV-HGFK1； Gene therapy； Hepatocellular carcinoma； Prognosis

原發(fā)性肝癌為我國特別是農(nóng)村地區(qū)高發(fā)惡性消化道腫瘤之一，由于其早期臨床主要表現(xiàn)為右下腹隱痛、嘔心嘔吐以及消化不良等胃腸道非特異性表現(xiàn)，故早期陽性診斷水平較低[1]，而以手術為主聯(lián)合術后放化療等治療方式并未取得滿意療效，其術后五年生存率約30%～45%。近年來臨床上對于原發(fā)性肝癌的基因水平的治療取得了一定成效，通過轉染抑癌基因等基因片段進入癌細胞組織中，通過抑制相關信號通路的激活等方式來抑制腫瘤細胞增值、轉移[2，3]。本研究通過對原發(fā)性肝癌患者進行AAV-HGFK1+Adv-p53和AAV-HGFK1基因治療，揭示腺病毒-P53對于治療肝癌治療的潛在價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我科2009年1月～2012年1月進展期肝癌患者共50例，均符合第四屆全國肝癌會議修訂標準（1999年）[1]。納入標準：①具有完整的肝功能、AFP、CT或MRI檢查資料；②預計壽命超過12周，體能狀態(tài)評分（ECOG）0～2分；③之前未經(jīng)過手術、放療、射頻消融、栓塞化療、肝動脈灌注、冷凍消融、經(jīng)皮乙醇注射等治療；④無嚴重的心、肺、腎或造血系統(tǒng)疾病。排除標準：①入組前接受過針對肝癌任何形式的治療；②預計壽命<12周或ECOG>2分；③合并嚴重的心、肺、腎或造血系統(tǒng)疾病；④妊娠或哺乳期女性。隨機分為AAV-HGFK1+Adv-p53組和AAV-HGFK1組，其中AAV-HGFK1+Adv-p53組25例，男17例，女8例；年齡37～64歲，平均（51.9±3.3）歲；腫瘤直徑3.1～10.8 cm，平均（5.4±0.8）cm；腫瘤數(shù)目1個7例，2個4例，≥3個14例；伴有肺轉移9例，骨轉移1例；侵犯門脈主干5例。AAV-HGFK1組25例，男18例，女7例；年齡39～66歲，平均（52.4±3.5）歲；腫瘤直徑3.6～10.2 cm，平均（5.7±0.2）cm；腫瘤數(shù)目1個8例，2個5例，≥3個12例；伴有肺轉移10例，骨轉移2例；侵犯門脈主干6例。兩組患者性別構成、年齡、腫瘤直徑和數(shù)目、轉移及侵犯血管情況差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

采用OlympusXQ260電子顯微鏡，在彩色電子顯微鏡屏幕指示下，通過逆行膽管造影方式，在肝臟原發(fā)性肝癌組織進行多點注射，AAV-HGFK1注射劑量為1×1012 VP，Adv-p53注射劑量為2×1012 VP（Adv-p53和AAV-HGFK1注射液均購自南京凱基生物科技有限公司，規(guī)格：1×1024 VP/支）。每周1次，每5次為一個療程，針刺深度應適宜，一般達正常組織交界處即可，不必超越腫瘤組織而進入正常肝細胞組織內。

1.3 評價指標

1.3.1 新生微血管和凋亡細胞率 對兩組患者治療后肝穿刺活檢標本進行組織石蠟切片，免疫組化染色。其中兔抗小鼠vWF多克隆抗體和羊抗人HGFK1多克隆抗體購自上海研晶實業(yè)科技有限公司。UFX-DX倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。陽性細胞為棕色，新生微血管計數(shù)首先在低倍鏡視野下確定腫瘤內新生微血管最密集區(qū)域，之后在高倍鏡視野內計數(shù)5個視野，取5個視野中的新生微血管平均數(shù)。凋亡細胞率檢測采用原位細胞凋亡檢測試劑盒（購自深圳紐邦生物科技有限公司），檢測方法按照試劑盒說明書進行。在高倍鏡視野內選取5個區(qū)域進行凋亡細胞和總細胞計數(shù)，凋亡細胞率為二者比值。

1.3.2 臨床療效 采用mRECIST評價標準，評價兩組患者治療效果。分為完全緩解（CR）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，同時已知病灶消失；部分緩解（PR）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，同時已知病灶最大直徑總和縮小>30%；疾病穩(wěn)定（SD）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，但未達CR、PR或PD標準；疾病進展（PD）：出現(xiàn)新病灶或已知病灶最大直徑總和增大>20%[2]。其中疾病控制率為CR、PR和SD患者占所有患者的比率，疾病緩解率為CR、PR患者占所有患者的比率。

1.3.3 隨訪 對于兩組患者進行隨訪，隨訪內容為：治療后1年內每3個月檢測一次血清甲胎蛋白（AFP）和腹部CT、胸部CT和骨掃描。1年后每半年復查一次。對比兩組患者1年、3年的復發(fā)率和生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療后新生微血管和凋亡細胞率比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細胞率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.01）。兩組患者治療后第21天的新生微血管數(shù)量和凋亡細胞率均顯著高于治療后第14天（P<0.01）。見表1、封三圖5、圖6。

2.2 兩組患者臨床療效比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為76.00%，顯著高于AAV-HGFK1組的48.00%（χ2=4.1596，P=0.041<0.05）；兩組患者的疾病緩解率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.9138，P>0.05）。見表2。

2.3 兩組患者復發(fā)率和生存率比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組的平均隨訪時間為（37.1±4.4）個月（4～51個月），AAV-HGFK1組的平均隨訪時間為（18.4±2.7）個月（3～39個月）。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復發(fā)率分別為20.00%和44.00%，1年、3年生存率分別為92.00%和80.00%；AAV-HGFK1組1年、3年復發(fā)率分別為68.00%和72.00%，1年、3年生存率分別為52.00%和40.00%。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年、3年生存率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者復發(fā)率和生存率比較[n（%）]

3 討論

現(xiàn)階段對于原發(fā)性肝癌的治療越來越傾向于基因水平的干預治療，鑒于傳統(tǒng)手術切除原發(fā)肝癌組織并適度聯(lián)合術后放療或者化療的方式，并未顯著改善患者術后5年生存率或者中位生存時間，科研工作者以及一線臨床醫(yī)生越來越傾向于通過轉染抑癌基因來干擾腫瘤細胞增殖以及轉移[4]。HGFK1為79個氨基酸組成的環(huán)形結構，最早被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制成纖維細胞生長因子而促進牛血管內皮細胞增殖，Jin B等[5]研究發(fā)現(xiàn)HGFK1拮抗肝原發(fā)性癌細胞增殖以及抗局部微血管形成作用主要通過EGF/EGFR或者VEGF/VEGFR信號通路激活來實現(xiàn)，同時 Jin B等在大鼠肝癌模型中發(fā)現(xiàn)，HGFK1能顯著降低肝細胞癌局部微血管密度，阻斷相應的肺部腫瘤轉移的發(fā)生；而P53基因主要通過促進受損DNA細胞凋亡、調控細胞周期、修復DNA異常甲基化或者磷酸化等損傷，實現(xiàn)其抗腫瘤效應，而突變型P53不僅難以維持正常細胞周期，還可能加劇相關腫瘤信號通路激活促進腫瘤細胞增殖，而 Cheung PF等[6]學者發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者體內P53基因突變型約占78%～85%，提示肝癌患者體內P53難以發(fā)揮其抗腫瘤效應。本研究重在探討AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53治療原發(fā)性肝癌的療效，以揭示相應的基因治療對于肝癌治療的潛在價值。

本研究在分析進展期肝癌患者共50例（包括對照組25例和觀察組25例）相應的基因治療的效果后發(fā)現(xiàn)，AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細胞率顯著高于AAV-HGFK1組，與Wei JC等[7]學者的結論相似。Wei JC等[7]發(fā)現(xiàn)P53通過腺病毒成功轉染入原發(fā)性肝癌細胞內后，通過抑制G0期細胞快速進入G1期并顯著降低G2/S期細胞比例抑制腫瘤細胞增殖，同時通過激活CMAP/pka/cmyc信號通路促進肝癌細胞凋亡，同時Wei JC等學者發(fā)現(xiàn)，P53成功轉染后，肝癌細胞局部微環(huán)境顯著發(fā)生改變，局部血管密度顯著降低，腫瘤微環(huán)境中肝癌腫瘤干細胞比例以及活性顯著降低，并認為P53可能通過fasl/caspase8/BAX來抑制局部微血管增生；對于兩組患者臨床療效的對比，本研究發(fā)現(xiàn)AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為76.00%，顯著高于AAV-HGFK1組48.00%，但兩組患者的疾病緩解率尚無統(tǒng)計學差異，考慮AAV-HGFK1+Adv-p53治療后，可能通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、降低局部微血管密度改善患者預后[8-14]，與Hu S[15]、陸玉敏等[16]學者的研究結果一致，Hu S等[15]學者發(fā)現(xiàn)，P53或者單獨AAV-HGFK1轉染機體腫瘤細胞后，其臨床轉歸明顯優(yōu)于對照組，同時遠處轉移的發(fā)生率由37%顯著下降至15%，Hu S等[15]學者通過腺病毒轉染P53入145例亞洲原發(fā)性晚期肝癌患者局部腫瘤組織細胞內后發(fā)現(xiàn)，患者術后中位生存由（78.5±11.3）個月顯著上升至（89.5±14.8）個月，但本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組患者疾病緩解率的差異，考慮可能與本研究樣本量不足有關，同時觀察時間可能不足導致統(tǒng)計學差異無法體現(xiàn)。最后本研究對于兩組患者出院后相關臨床預后進行分析后發(fā)現(xiàn)，AAV-HGFK1+Adv-p53組1年復發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年生存率顯著高于AAV-HGFK1組，進一步確認了AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進行基因治療的重要臨床價值。

在注意到AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進行基因治療的臨床療效的同時，部分學者認為，AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進行基因治療的臨床有效情況以及相關預后情況的改善主要取決于原發(fā)性肝癌患者體內P53或者HGF的突變型比例[17，18]，如 Giovannini C等[19]學者注意到，一旦P53或者HGF的突變型比例低于40%，相關的基因治療對于原發(fā)性肝癌特別是晚期患者基本未見有顯著差異的療效，同時相關術后中位生存時間并無改善。史守良[20]、王苗等[21]學者也發(fā)現(xiàn)，P53或者HGF的突變型/野生型比例高于2.5時，相關肝癌患者術后五年生存率僅由45%升高至49%，且未見統(tǒng)計學差異，這都提示臨床醫(yī)生在不應盲目采用基因治療，應在綜合衡量后采用合適的治療方案。

綜上所述，Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合治療進展期肝細胞癌療效優(yōu)于AAV-HGFK1，并通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、降低局部微血管密度等途徑，提升患者的臨床控制率，并有利于改善患者出院后一年內肝癌的復發(fā)率以及生存率，但對于相關基因突變導致的臨床有效率的問題需進一步大樣本研究。

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（收稿日期：2015-05-06）