沙棘葉總黃酮的提取工藝優化

李淑珍　武　飛　陳月林　楊　穎

1.烏蘭察布醫學高等專科學校，內蒙古　烏蘭察布　012000；

2.內蒙古自治區烏蘭察布中心醫院，內蒙古　烏蘭察布　012000

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沙棘葉總黃酮的提取工藝優化

李淑珍1武飛2*陳月林1楊穎1

1.烏蘭察布醫學高等專科學校，內蒙古烏蘭察布012000；

2.內蒙古自治區烏蘭察布中心醫院，內蒙古烏蘭察布012000

【摘要】目的：對沙棘葉總黃酮的提取工藝進行優化。方法：采用溶劑浸提法提取沙棘葉總黃酮，利用分光光度法測定總黃酮的含量，正交試驗進行優化。結果：取7月份沙棘葉粉碎物，過35目篩，經正交實驗優化后的提供工藝為：用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g葉粉碎物經提取可得8.71g粗制品，總黃酮提取率達0.14%。結論：上述工藝操作簡單、方法可靠，產品得率高，提取性能較好，適合于沙棘總黃酮大規模提取。

【關鍵詞】沙棘葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗

沙棘(HippopherhamnoidsL.)屬胡頹子科沙棘屬植物，又名醋柳，被國際醫藥學家和營養學家譽為人類21世紀最具發展前途的醫藥及營養保健植物。其根、莖、葉、果實等都含有維生素、黃酮類化合物和豐富的礦物質元素等，為藥食同源植物，并廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等多個領域[1]。沙棘1977年收載于《中華人民共和國藥典》，所含的黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保護心血管等多種生物活性[2-3]。內蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實質量高等特點，對沙棘產業的發展十分有利。且沙棘作為防護林發揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。而沙棘果實黃酮的開發已經報道很多[4-5]，從葉中提取黃酮類化合物也具有原料來源廣泛、成本低廉的優勢[6]。研究從沙棘葉提取黃酮，旨在篩選適合沙棘葉黃酮的提取工藝，獲取高含量的總黃酮，促進沙棘資源的綜合利用。

1儀器與試劑

1.1儀器722可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器廠)；RE-52旋轉真空蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；101-2型數顯電熱鼓風恒溫干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)。

1.2材料沙棘葉采于內蒙古烏蘭察布市(集寧區)卓資縣郊野，經楊鴻飛教授鑒定沙棘(HippopherhamnoidsL.)的葉。并將其充分粉碎，過35目篩，置于干燥器中備用。蘆丁對照品(批號：100080-201407，中國藥品生物制品檢定所)。其他試劑均為分析純。

2方法及結果

2.1沙棘葉總黃酮含量的測定

2.1.1標準曲線的制作準確稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標準品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其濃度為200μg/ml。分別取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即為40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的蘆丁溶液。各取1ml于試管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混勻后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm處測定不同濃度標準品的吸光值(亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法)。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。得回歸方程：Y=477.38X-2.261(R=0.9979)，結果表明蘆丁在0～120μg/ml濃度范圍內呈良好線性關系。

2.1.2樣品中黃酮含量的測定取一定量的沙棘葉黃酮樣品，配制成樣液。再取一定量總黃酮樣液，定容至某一體積。各取1ml于試管中，采用“2.1.1”項比色法測定吸光值，計算總黃酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X為樣品中總黃酮含量，Y為樣液中總黃酮濃度(mg/mL)，由回歸方程可算得；V為樣液體積(mL)；n為稀釋倍數；m為樣品量(mg)[7]。

2.2提取條件的優化

2.2.1提取溶劑的選擇取8份過35目篩的6月份沙棘葉粉碎物各1g，分別加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加熱提取10min，過濾。用70%乙醇統一定容到50ml，各取1ml于試管中，采用2.1.1項比色法測定吸光值，計算提取率。同樣方法做3次平行試驗，確定提取的最佳溶劑，結果見圖1。

由圖1可知，沙棘總黃酮在甲醇、乙醇、水等極性溶劑中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶劑中溶解度小，提取率低。在所測溶劑中，甲醇最好，但甲醇有毒，給操作帶來不便。由于乙醇具有、無異味、無殘留、安全性好等優點，且容易回收，故選用乙醇為提取溶劑。

2.2.2提取原材料的選擇取5份過35目篩的5～9月份沙棘的葉粉碎樣品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加熱提取30min，過濾，蒸發乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀釋取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于試管中，測定吸光值，計算總黃酮含量，選擇最佳提取原材料。

黃酮化合物是植物生理過程中的次生代謝產物，這些物質的往往受到植物發育階段酶的調節和遺傳機制的控制。不同發育階段黃酮化合物含量不同。由圖2可知，5月份日照時間長，植物正處在生長的旺盛階段，故5月份黃酮含量高；隨后植物生長變緩，合成量減少或轉化為其他物質，故含量下降。但西北地區5月份葉子處于發芽階段，產量低，不宜選用。7月葉子已經長成，也未結果，又出現了黃酮含量的高峰，不宜用7月份葉作為實驗原材料。

2.2.3多因素正交試驗在單因素篩選的基礎上，設計多因素試驗表，見表1。取7月份葉粉碎樣品1g，按照下列正交試驗條件進行提取、過濾，用70%乙醇統一定容至30ml。各取1ml于試管中，測定吸光值，計算總黃酮含量，確定優化后的提取條件。

表1　沙棘總黃酮提取條件的正交試驗結果

表2　沙棘總黃酮提取條件正交試驗結果的方差分析

F0.05(3，3)=9.277F0.01(3，3)=29.46

多因素正交試驗結果見表1，直觀分析得出：葉中提取總黃酮的影響因素的順序是：C>B>A>D，即提取溫度>固液比>乙醇濃度>提取時間，優化組合后的提取因素的選擇為A2B2C3D1。方差分析的結果見表2，影響提取沙棘總黃酮各因素均為極顯著因子(P<0.01)。綜合考慮最佳的提取條件為A2B2C3D1，即取7月份葉，用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，提取效果較好。

2.3沙棘總黃酮的得率和含量測定準確稱量沙棘7月份葉粉碎物100g，按上述確定的優化提取條件進行浸提，將浸提液在60℃減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液在60℃的干燥箱干燥，稱量干燥粗制品的質量，得到粗黃酮產品得率。從中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀釋一定倍數，取1ml測定粗制品總黃酮含量，結果見表3。

表3　沙棘總黃酮粗制品總黃酮含量測定結果

由表4可知，100g葉粉碎樣品經此提取條件提取，可得到8.71g粗黃酮產品，葉粗制品黃酮含量達0.14%，并且RSD為0.68%，純化后總黃酮含量達到14.89%，表明該工藝重復性強，穩定可靠，精密度高。

3討論

內蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實質量高等特點，對沙棘產業的發展十分有利[8]。且沙棘作為防護林發揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。有研究發現沙棘所含總黃酮為葉子(876mg/100g)>果渣(502mg/100g)>鮮果汁(365mg/100g)>鮮漿果(354mg/100g)，說明從葉中提取黃酮具有重要意義[9]。對于從沙棘中提取總黃酮的方法，目前有超臨界CO2流體提取、微波法提取、超聲波法提取、有機溶劑提取、水浸提取等。超臨界CO2萃取適用于非極性化合物的分離；微波法和超聲波法提取僅限于少量提取實驗，工業化大生產不宜應用。水浸提取沙棘總黃酮提取率偏低；有機溶劑提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黃酮是適合工業化生產的適宜方法[10]。該方法經實驗優化，60%乙醇作為提取溶劑，提取30min，既節約時間，且乙醇還可以重復利用，無毒害無殘留，適合工業化擴大生產。經優化工藝提取后所得葉黃酮得率為8.71%，相對較高，但黃酮含量(0.14%)較呂敏[11]采用正交試驗法優選提取山西沙棘HippopherhamnoidsL.葉總黃酮含量(4.82%)較低，這可能與不同品種的沙棘黃酮含量不同有關。王亞輝等[12]對內蒙古不同產區同一品種沙棘黃酮含量研究發現：內蒙古和林格爾縣(2.5±0.07)%>內蒙古涼城縣(2.3±0.02)%>內蒙古東勝區(2.2±0.08)%>內蒙古翁牛特旗(1.8±0.01)%>內蒙古敖漢旗(1.7±0.09)%>內蒙古集寧區(1.4±0.01)%。除集寧外，5個產區的總黃酮含量均達到《中國藥典》標準(1.5%)。實驗選用沙棘品種恰好來自集寧區卓資山縣，提取原材料并非5月份含量最高季節采收，而是產量較高的7月份采收，原料只提取1次，而呂敏實驗提取三次，所以該實驗黃酮含量相對較低。與其他研究結果比較[13-15]，產品得率較高，并且該提取工藝操作簡單、乙醇無殘留可重復利用，適合于沙棘總黃酮的提取，可進行規模化生產。

參考文獻

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Optimize total flavonoids extraction process from leaves of Hippophae rhamnoides L．

LI Shuzhen1WU Fei2*CHEN Yuelin1YANG Ying1

1.Wulanchabu medical college, Inner Mongolia , wulanchabu 012000,China;

2. Wulanchabu central hospital,Inner Mongolia,wulanchabu 012000,China

Abstract:Objective The optimize total flavonoids extraction technology of Hippophae rhamnoides L．leaves. Methods Solvent-extraction process was used for flavonoids extraction,spectrophotometry was used to analyze the contents and the orthogonal experiment was used to optimize extraction process．Results The extraction materials were leaves of Hippophae rhamnoides L. in July,which was crushed 35 mesh. The optimum extracted conditions were 80℃, 1∶20(W/V),extracting 30 min for each time, the flavonoids content of product reached to 0.14 % , product yield was 8.71%.Conclusion The total flavones from leaves of Hippophae rhamnoides L. can be extracted by above-mentioned method, this process was simple, reliable and can get high purity product and ethanol can be reused repeatedly,the process suitable for mass production the total flavones.

Key words:Leaves of Hippophae rhamnoides L.; Total flavonoids; Extraction process; The orthogonal experiment

(收稿日期：2015.09.23)

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)01-0014-03

作者簡介：李淑珍(1974-)，女，蒙古族，碩士研究生，副教授，主要從事天然產物的研究與開發。E-mail：448609108@qq.com通信作者：武飛(1976-)，男，蒙古族，碩士研究生，副主任醫師，主要從事新藥研發。E-mail：wufeiyisheng0812@126.com

基金項目：內蒙古自治區教育廳高等學校科學技術研究項目(NJZC14407)。