木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性研究

楊雨婷　何貝軒　彭　成，2　張　雪　盧俊宇　熊　亮，2　何育霖　曹治興 *

1. 成都中醫藥大學，四川　成都　611137；

2.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川　成都　610075

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木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性研究

楊雨婷1,2何貝軒1彭成1，2張雪1,2盧俊宇1熊亮1，2何育霖1曹治興1,2 *

1. 成都中醫藥大學，四川成都611137；

2.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都610075

【摘要】目的：以斑馬魚胚胎為模型，研究木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性及心臟發育毒性的影響。方法：采用斑馬魚胚胎模型，將其暴露于含有不同濃度(50、25、12.5、6、3、1.5mg·L-1)的木香及藏木香揮發油中培養96h，于24，48，72，96hpf觀察斑馬魚胚胎發育形態，畸形率，24hpf擺尾率，48hpf心率及各時間點的死亡率。結果：24hpf，藏木香揮發油和木香揮發油對斑馬魚胚胎毒性的LC50分別為12.71、44.88mg·L-1； 96hpf藏木香揮發油和木香揮發油對斑馬魚胚胎毒性的LC50分別為7.11、17.18mg·L-1。在6mg·L-196hpf藏木香揮發油胚胎發育主要表現為脊柱側彎、心臟水腫、卵黃囊水腫；而相同濃度、相同劑量的木香揮發油則未監測到該現象。12mg·L-1藏木香揮發油可致斑馬魚擺尾次數和心率明顯下降(P<0.01)，木香揮發油則無明顯影響(P>0.05)。結論：藏木香和木香揮發油對斑馬魚毒性大小：藏木香揮發油>木香揮發油。

【關鍵詞】藏木香揮發油；木香揮發油；斑馬魚；胚胎發育毒性

斑馬魚是鯉科短擔尼魚屬，原產于南亞，是一種常見的熱帶魚。目前的生命科學研究中，斑馬魚是三種主要模式脊椎動物之一，被世界廣泛關注，是公認的新興模式脊椎動物。斑馬魚個體小，能大規模繁殖；體外受精，胚胎發育透明，胚胎早期發育快，易于大量獲取實驗所需樣品。因其早期發育身體透明，易于對胚胎發育過程進行直接觀察，且對母體無傷害，故可用作毒性學評價模型[1]。

木香為菊科多年生草本植物木香AucklandialappaDecne.干燥根，主產于云南等地。木香主要含揮發油，其氣味芳香濃烈而特異，有行氣止痛之功效，被廣泛用于治療脾胃、大腸及肝膽氣滯證等[2]。臨床上木香被廣泛應用，為濕濁中阻嘔吐之要藥，可單用或配伍用于治療妊娠嘔吐。藏木香是一味民間藏藥，又名青木香，藏名“瑪奴”，為菊科植物藏木香InularacemosaHook.f. 的干燥根，其味辛、苦，性溫，具有調氣解郁、健脾和胃、止痛等功效，臨床上常用于治療胎動不安、胃腸功能紊亂等癥[3]。目前，木香及藏木香揮發油的安全性評價對比研究尚未見報道，故本課題采用斑馬魚模型，對木香及藏木香揮發油進行體內胚胎發育的安全性比較實驗。

1實驗與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物木香揮發油、藏木香揮發油(成都中醫藥大學藥物研究所，批號20150222)，均以二甲基亞砜(DMSO)配成50mg·L-1的濃縮液備用。

1.1.2實驗動物健康AB品系野生型斑馬魚，由四川大學生物治療國家重點實驗室饋贈。培育于成都中醫藥大學斑馬魚實驗室。

1.1.3主要儀器與試劑氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀等試劑(使用試劑均為分析純，廠家：成都市科龍化工試劑廠 批號：144-55-8)；二甲基亞砜(DMSO，SIGMA公司，批號：SZBE0170V)，體視熒光顯微鏡(Leica 型號M165Flc)：斑馬魚循環水養殖系統(北京愛生科技公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；光照培養箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號MGC-100)；斑馬魚胚胎繁殖培養液10% Hank′s液(13.7mmol/L NaCl，0.54mmol/L KCl，0.025mmol/L Na2HPO4，0.044mmol/L KH2PO4，1.3mmol/L CaCl2，1.0mmol/L MgSO4，0.42mmol/L NaHCO3)。

1.2方法

1.2.1胚胎收集依照斑馬魚及相關實驗技術[4]中所述方式，傍晚，將正常成年斑馬魚雌∶雄=1∶1，放入產卵盒內，用隔板分離。水溫控制在27.5℃～28.5℃，控制光周期為14∶10(即光照14h，黑暗10h)，至次日早晨轉變為光照期配對，3h后吸去糞便等污物，用10% Hank′s液沖洗數次，選取發育正常的胚胎進行實驗。

1.2.2給藥方法將配置好的木香及藏木香揮發油的濃縮液加入新鮮10%Hank′s液中，按二倍梯度稀釋法，稀釋為6個濃度，即50、25、12、6、3、1.5mg·L-1，于10hpf將斑馬魚胚胎暴露于藥液中，按20個/孔置于24孔板，每孔容積為1.5ml，以DMSO為溶劑對照，并設置空白對照，置于培養箱中孵化96h。

1.2.3觀察指標從10hpf起連續培養在對應濃度的對照組和藥液中，分別在24hpf、48hpf、72hpf、96hpf于顯微鏡下觀察記錄胚胎發育情況，統計藥物作用于斑馬魚胚胎發育過程中的死亡率、畸形率、成活率和心率等指標，并以死亡率計算不同時間點的LC50。

1.3統計學方法采用SPSS17.0統計分析軟件中的方差分析法檢驗各實驗組及對照組之間的差異，并采用兩兩配對多重比較的方法分析各組之間差異的統計學意義，檢驗水準a=0.05。

3結果

3.1木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎死亡率的影響以胚胎死亡為終點觀察指標，給予木香及藏木香揮發油不同濃度和不同暴露時間，結果，在48hpf內，隨著暴露時間的延長，兩組斑馬魚胚胎死亡率均逐漸增加。其中，作用24h時，木香揮發油、藏木香揮發油對斑馬魚胚胎毒性的LC50及95%置信區間分別為 44.88(34.36～72.11)、12.71(9.42～17.23)mg·L-1；作用48h時LC50的95%置信區間分別為17.18(14.52～21.56)、7.11(5.50～9.07)mg·L-1。具體實驗結果見表1。結果表明，兩個藥物均對斑馬魚有胚胎發育毒性，其毒性為木香揮發油>藏木香揮發油。

表1　木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育的LC50(24hpf、48hpf、96hpf)

3.2.2木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎存活率的影響斑馬魚胚胎暴露于含有木香或藏木香揮發油12mg·L-1的10% Hank′s液，10hpf～48hpf隨著藥物暴露時間的延長，斑馬魚胚胎的毒性逐漸增強，而在48～96hpf時間段內，未見毒性蓄積效應。從表2可見，在相同作用時間和作用濃度下，毒性從小到大依次為木香揮發油>藏木香揮發油。

表2木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎成活率的影響

注：與木香揮發油組比較，**P<0.01

3.2.3木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育形態學的影響分別于24hpf、96hpf在顯微鏡下觀察斑馬魚的形態發育，拍攝木香及藏木香揮發油組在12mg·L-1和6mg·L-1的胚胎發育情況(見圖1)。24hpf空白對照組已出膜為幼魚，正常發育； 24hpf 12mg·L-1和6mg·L-1木香揮法油組出現不同程度的脊柱側彎；對應濃度的藏木香揮發油組表現出心臟和卵黃囊腫大、脊柱側彎； 96hpf 空白對照組； 96hpf 木香揮發油組僅 12mg·L-1脊柱稍微側彎，藏木香揮法油組表現出不同程度的心臟卵黃囊腫大、脊柱側彎。

注：A. 24hpf空白對照組；B. 24hpf 12mg·L-1木香揮法油組：脊柱嚴重側彎；C. 24hpf 6mg·L-1木香揮法油組：脊柱彎曲；D. 24hpf 12mg·L-1藏木香揮法油組；E.24hpf 6mg·L-1藏木香揮法油組：心臟腫大；F. 96hpf 空白對照組；G. 96hpf 12mg/L木香揮法油；H.96hpf 6mg/L木香揮法油：正常發育；I. 96hpf 12mg/L藏木香揮法油；J. 96hpf 6mg/L藏木香揮法油。

3.2.4木香及藏木香揮發油對斑馬魚擺尾次數的影響斑馬魚胚胎發育至24h，其尾部會表現出強烈的抽動，當將其暴露于上述藥物時，由于發育異常而影響此擺尾活動。于24hpf，12mg·L-1濃度下記錄1min內斑馬魚幼魚的擺尾次數。結果顯示，，正常對照組胚胎擺尾次數為4.50次·min-1，藏木香揮發油組1.13次·min-1，有差異具有統計學意義(P<0.01)，木香揮發油3.91次·min-1,與空白對照比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果詳見表2。

表3　木香及藏木香揮發油作用24h對

3.2.5木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育的畸形率與空白對照組比較，木香及藏木香揮發油在12 mg·L-1時，48hpf，藏木香揮發油的畸形率高于木香揮發油組，結果差異具有統計學意義(P<0.05)，但在48h后，木香及藏木香揮發油的畸形率不變。結果見表4。

表4　木香及藏木香揮發油致斑馬魚胚胎畸形發育

注：與木香揮發油組比較，**P<0.01。

3.2.6木香及藏木香揮發油對斑馬魚心率的影響48hpf，在顯微鏡下記錄30s內斑馬魚心跳次數。選取最低毒性劑量12mg·L-1記錄各組斑馬魚心率次數，比較藏木香揮法油和木香揮法油對斑馬魚心臟發育的影響。結果顯示，與空白對照組比較，藏木香揮發油組和木香揮發油的斑馬魚心率明顯減慢。結果見表5。

±s)

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

4討論

《日華子本草》記載木香有“治心腹一切氣，止瀉，霍亂，痢疾，安胎，健脾消食。療羸劣，膀胱冷痛，嘔逆反胃”之效；《西藏常用中草藥》記載藏木香有“健脾和胃、調氣解郁、止痛、安胎。治慢性胃炎、胃腸機能紊亂、肋間神經痛、胸壁挫傷和岔氣作痛”的功效，近期研究表明，木香及藏木香均有不同程度的抗腫瘤作用，可作為臨床潛在的抗癌開發藥物[5-6]。 但對于藏木香和木香的基礎毒性研究報道甚少[7]，且傳統的動物毒性無法實時直觀地觀測到藥物對于胚胎發育的影響，也無法快速大量地統計藥物對于胚胎發育致畸的影響。故本實驗利用斑馬魚胚胎發育透明、對藥物作用敏感且能直接觀測到藥物對于斑馬魚胚胎發育作用的特性，探討木香及藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育的影響。實驗結果表明，24hpf擺尾次數，48hpf的心率、各時間點的存活率、畸形率及斑馬魚形態發育指標可看出，木香揮發油較藏木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性小，木香揮發油對斑馬魚胚胎的LC50亦明顯高于藏木香揮發油。由此可見，木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性較藏木香揮發油安全。提示臨床用藥時，有必要重視藏木香對胚胎發育的影響，建議孕婦和哺乳期的婦女慎用該藥物，也不應長期或大量給予嬰幼兒使用含有藏木香揮法油的藥物；木香雖較藏木香安全，但在所設定的劑量范圍內，木香揮發油仍有致畸作用，故建議進一步采用多種模型確立其安全范圍，為臨床合理用藥提供依據。

參考文獻

[1]Westerfield M. The Zebrafish Book[M].Eugene:University of Oregon Press,1993.

[2]國家藥典委員會.中國藥典.一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010:57-58.

[3]Lokhande.PD,Dhaware.BS,Jagdale.SC, et al.Cardiac activity of isolated consitituents ofInularacemosa[J].Journal of Herbal Pharmacotherapy.2006,6(3-4):81-88.

[4]董武.斑馬魚及相關實驗技術[M].青島：中國海洋大學出版社，2006,6-8.

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[6] Pal HC,Sehar I,Bhushan S,et al.Activation of caspases and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage to induce apoptosis in leukemia HL-60 cells by Inula racemosa[J].Toxicology in Vitro,2010,6(24):1599-1609.

[7] 李茹柳，黃習文，李衛民，等.厚樸丸方中單味藥木香藥效學和急性毒性研究[J].中藥藥理與臨床，2009,25(2)：82-84.

Toxicity of the oil ofAucklandialappaDecne. and the oil ofInularacemosaHook.f. to zebrafish embryos

YANG Yuting1,2HE Beixuan1PENG Cheng1,2ZHANG Xue1,2LU Junyu1XIONG Liang1,2HE Yulin1CAO Zhixing1,2*

1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137，China

2.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM, Chengdu 610075，China

Abstract:Objective The difference toxicity between the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. to the developing zebrafish embryos.Methods LC50,survival rate, spontaneous movement of embryos, heart beat rate and morphologic change were detected in 10h zebrafish embryos with incubation of the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. for 96h.Results The LC50values of the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. were 12.71 mg·L-1and 44.88mg·L-1at 24hpf respectively; The LC50values of the oil of Aucklandia lappa Decne. and the oil of Inula racemosa Hook.f. were 7.11 mg·L-1、17.18mg·L-1at 96hpf,respectively. 6 mg·L-196hpf zebrafish larvae with the characteristic of was scoliosis,cardiac edema and yolk edema for the oil of Inula racemosa Hook.f..But these phenomena did not occur to the oil of Aucklandia lappa Decne. in the same condision. The oil of Inula racemosa Hook.f. caused the reduction of spontaneous movement and heart rate(P<0.01)，the oil of Aucklandia lappa Decne.had no effect on it.(P>0.05)Conclusion Compared with the oil of Aucklandia lappa Decne., the oil of Inula racemosa Hook.f. had lower toxicity to zebrafish embryos

Key words:zebrafish embryos; toxicity; the oil of Aucklandia lappa Decne.; the oil of Inula racemosa Hook.f.

(收稿日期：2015.09.28)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)01-0023-03

作者簡介：楊雨婷，研究生在讀，主要從事中藥藥理與毒理學研究，E-mail：349802920@qq.com通信作者：曹治興，博士，講師，主要從事腫瘤分子生物藥效學和毒理學，E-mail：284886361@qq.com

基金項目：國家科技支撐計劃(2011BAI13B05)。