萼脊蘭EF1α基因片段的克隆及序列分析

蔣素華， 王默霏， 宋彩霞， 梁 芳， 李艷輝， 崔 波*

(1.鄭州師范學院 生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.河南農業大學 生命科學學院， 河南 鄭州 450002； 3.封丘縣農業局， 河南 新鄉 453300)

萼脊蘭EF1α基因片段的克隆及序列分析

蔣素華1， 王默霏1， 宋彩霞2， 梁 芳1， 李艷輝3， 崔 波1*

(1.鄭州師范學院 生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.河南農業大學 生命科學學院， 河南 鄭州 450002； 3.封丘縣農業局， 河南 新鄉 453300)

為探明萼脊蘭EF1α基因在生長發育過程中的生理功能和作為內參基因的穩定性及適用性，根據NCBI中植物翻譯延長因子同源核苷酸保守序列設計簡并引物，以萼脊蘭葉片為試驗材料，采用RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，利用RT-PCR技術克隆翻譯延伸因子EF1α，并進行生物信息學分析。結果表明：EF1α基因長620 bp，編碼206 個氨基酸，編碼的蛋白為親水性蛋白，相對分子質量為23.16 KD，等電點為8.50；經二級結構分析，α-螺旋占29.61%，延伸鏈占31.55%，無規則卷曲占38.83%；亞細胞定位在細胞質；EF1α基因與朵麗蝶蘭雜交品種翻譯延伸因子蛋白的一致性較高，進化距離最近。在GenBank登錄號為KT223116。

萼脊蘭；EF1α； 基因克隆； 二級結構

在單子葉植物中，蘭科是第二大科。萼脊蘭(Sedireajaponica) 為蘭科(Orchidaceae)萼脊蘭屬(Sedirea)，萼脊蘭的花小而素雅，其花色典雅且具有迷人的芳香，觀賞期較長，養護簡單，且耐寒[1-2]。萼脊蘭的莖被宿存的葉鞘所包，葉片長圓形、倒卵形或披針形，苞片為凹的寬卵形，淡褐色，花梗以及子房長為18 mm左右；花香與橘子香相似，有萼片，花瓣橢圓形，細圓柱形的蕊柱，花期一般為6月[3-4]。

蛋白質的生物合成是十分復雜又普遍的生命現象，蛋白質合成分為起始階段、延伸階段和終止階段[5-6]。蛋白質的生物合成需要許多生物大分子參與，如啟動子、終止子、核糖體、氨酰合成酶、信使RNA、tRNA和延伸因子等[7]。植物蛋白質合成延伸因子有EF1和EF2，其通過在核糖體上催化氨基酸鏈的延伸而推動和控制蛋白質的合成，在植物生長代謝過程中發揮重要作用[8-10]。EF1α是主要的翻譯因子之一，調控蛋白質的翻譯過程，基因表達及調控非常保守，幾乎存在于每個細胞內，僅次于肌動蛋白，在真核生物體內屬于數量較多的一類蛋白。目前，許多植物中都可以克隆得到EF1α，如油桐、油棕、玉米、擬南芥、蘋果、沙梨、碧桃、可可樹、中果咖啡、亞麻芥、金絲小棗、甘蔗、棉花、玫瑰和水稻等植物[11-13]。

在蛋白質合成中起重要作用的延伸因子是一種多功能的蛋白因子[14-15]。其還與細胞生長與增殖速度有關，除參與翻譯控制[16]、應激反應、細胞生長和運動性有關的信號傳導[17]外，還可與細胞結構結合[18]，如細胞骨架和有絲分裂裝置等，與細胞骨架的結合可以顯著提高蛋白質的翻譯[19-20]。但有研究發現，eEF1A在香蕉果實采摘后的不同時期以及在香蕉不同器官中的表達均有差異，即其在細胞中的表達并不是恒定不變，在不同的生理狀態下，不同細胞類型中都有差異[21]。因此，研究萼脊蘭的內參基因顯得尤為重要。而在萼脊蘭相關基因的研究中，對萼脊蘭內參基因的研究尚未見報道。筆者采用萼脊蘭葉片為材料，利用RT-PCR的方法，克隆萼脊蘭的EF1α基因序列，并進行生物信息學分析，以期為下一步萼脊蘭相關基因的表達分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

萼脊蘭由鄭州師范學院蘭花工程技術中心的智能日光溫室培養。

1.2 試驗試劑

氨芐青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受態細胞和pMD19-T載體購自TaKaRA公司，凝膠回收試劑盒和RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自天根試劑公司，LB固體/液體培養基為實驗室保存配制試劑。

1.3 萼脊蘭EF1α基因的克隆

1.3.1 RNA的提取及檢測 將萼脊蘭葉片在液氮中研磨，用RNAprep多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取其總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，采用Quawell Q5000微量紫外可見分光光度計測定總RNA的A260/A280值和A260/A230值，同時測定其濃度。

1.3.2 cDNA的合成 反轉錄參照RevertAid TM First strand cDNA synthesis Kit說明書合成第1鏈cDNA，并于-20℃保存。

1.3.3EF1α基因RT-PCR擴增 以NCBI中已登錄的其他植物翻譯延伸因子同源DNA保守序列為參考，采用primer5.0設計1對克隆萼脊蘭EF1α基因的簡并引物：EF1aF，5′-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3′；EF1aR，5′-GCCYTTGTACCA

GTCAAGGTTG-3′。將設計的引物送到上海英俊生物技術公司合成。以萼脊蘭cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系：10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 μmol/L)1.6 μL，MgCl2(25 μmol/L)1.5 μL，F、R引物(10 μmol/L)各1.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，模板cDNA1.0 μL，定量補足ddH2O至20 μL。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，58.5℃復性30 s，72℃延伸40 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，按照凝膠回收試劑盒說明回收。

1.3.4 重組質粒的構建 取3 μL回收產物連接至pGEM-Teasy vector，構建重組質粒，將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布在含有50 mg/L氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB固體培養基上，置于37℃培養箱培養12 h，藍白斑篩選重組子。

1.3.5 重組質粒的鑒定和測序分析 挑取單克隆搖菌擴增，進行PCR鑒定，最后將陽性單克隆送上海英駿生物技術公司測序。序列分析使用http://www.expasy.org和http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/在線分析軟件，序列的檢索使用GenBank的Blast(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)，系統進化樹采用MEGA4.0 軟件中的NJ法構建系統樹。

2 結果與分析

2.1 萼脊蘭EF1α基因的RNA 完整性和基因克隆

由圖1可見，萼脊蘭總RNA溶液普通瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S、18S和5S條帶清晰，28S條帶的亮度大約是18S的2倍，OD260/280為1.8～2.1，RNA濃度為407.59 ng/μL。表明，提取的總RNA完整性較好，能夠進行下一步RT-PCR擴增。由圖2可見，cDNA經PCR擴增得到620 bp左右的片段，將圖2目的條帶切膠回收、培養和擴增，并電泳檢測，將檢測正確的單菌落測序，經過BLAST分析，測序結果正確，證明EF1α基因克隆成功。

2.2 萼脊蘭EF1α基因的序列比較

該片段的核苷酸序列與其他植物EF1α基因的核苷酸序列的同源性均在80%～85%，與其他植物氨基酸序列同源性也均在99%以上，反映出該基因在進化上較為保守，表明已克隆EF1α基因的部分cDNA序列，在NCBI上對EF1α編碼的蛋白質進行比對結果(圖3)顯示，該蛋白屬于延長因子1-alpha(EF1-alpha)蛋白家族，ABC-ATPase超家族。克隆的EF1α基因在GenBank注冊后登錄號為KT223116。

圖 1 萼脊蘭EF1α基因的總RNA

Fig.1 Total RNA extracted from geneEF1αfromS.japonica

注：M, DNA Marker 2 000; 1～2, SeAP1-like基因。

Note: M, DNA Marker 2 000; 1～2, SeAP1-like gene.

圖 2 萼脊蘭EF1α基因克隆

Fig.2 Gene clone ofEF1αfromS.japonica

圖3 萼脊蘭EF1α 基因的功能域

2.3 萼脊蘭EF1α基因編碼蛋白質的理化性質與二級結構

EF1α編碼編碼蛋白的分子量為23.16 KD，其中含量最豐富的氨基酸為賴氨酸(Lys)21 個，約占10.2%，其次是異亮氨酸(Ile)20 個，約占9.7%。帶負電的氨基酸(Asp+Glu)總共27 個、帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸總共30 個，等電點為8.50。由圖4可見，其二級結構主要有4種形式組成，α-螺旋(Alpha helix)占29.61%，延伸鏈(Extended strand)占31.55%，無則卷曲(Random coil)占38.83%。

注：H, α-螺旋；e, 延伸鏈；c,無則卷曲。

Note: H, alpha helix; e, extended strand; c, random coil.

圖 4 萼脊蘭EF1α 蛋白的二級結構

Fig.4 Protein secondary structure analysis of EF1α fromS.japonica

圖 5 萼脊蘭 EF1α氨基酸序列的親水性

圖6 萼脊蘭EF1α 的進化樹

2.4 萼脊蘭EF1α基因編碼蛋白質的親水性/疏水性與亞細胞定位在http://web.expasy.org/protscale/對EF1α編碼的蛋白分析(圖5)發現，平均親水系數為-0.311，蛋白其編碼的氨基酸序列屬于親水蛋白。在http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/上對其進行預測發現可能的位點在細胞質，進一步說明EF1α是翻譯延伸因子。

2.5 萼脊蘭EF1α基因的進化樹如圖6所示，萼脊蘭EF1α所編碼的蛋白與朵麗蝶蘭雜交品種的蛋白同屬一個分支，進化的同源性最高。

3 結論與討論

EF1α高度保守，分布廣泛，但并不是簡單的內參基因，還是一類具有多種生物學功能的重要調控蛋白，延伸因子參與蛋白合成、細胞調控和植物抗逆，研究延伸因子對植物發育和植物抗逆有重要意義，也為改良作物品質、提高作物抗逆水平提供研究基礎。因此，對EF1α生物學功能的研究具有重要的應用價值，為植物生理過程的研究和生產應用打開新思維。筆者研究克隆了萼脊蘭的EF1α基因片段，與其他植物EF1α基因的核苷酸序列的同源性均在80%～85%，與其他植物氨基酸序列同源性也均在99%以上，反映出該基因在進化上較為保守；蛋白質分析該蛋白屬于延長因子1-alpha(EF1-alpha)蛋白家族，ABC-ATPase超家族；屬于親疏水性蛋白，系統樹的進化分析發現，萼脊蘭EF1α編碼的蛋白與朵麗蝶蘭雜交品種的蛋白同屬一個分支，進化的同源性最高。

在很多植物中通過克隆得到延伸因子EF1α，如蘋果、碧桃、沙梨、玉米和水稻等[22-23]，由于延伸因子表達比較穩定，近幾年在許多文獻中都有以EF1α作為植物重要的內參基因，如香蕉延伸因子1A基因的分離及特征分析[24-25]，獨行菜Eef-1α基因片段分離克隆及RT-PCR分析[26]，本研究克隆并分析了EF1α基因，目的是研究其作為內參基因在萼脊蘭不同組織中的表達量是否一致，若一致并表達穩定，可將其列為看家基因。

本研究填補了萼脊蘭內參基因的空白，增加了EF1α基因研究領域，內參基因的表達在不同類型的細胞、組織中并不完全相同，在不同的試驗條件下的表達也不相同，因此選擇合適的內參基因顯得尤為重要，合適的內參基因的選擇，需要不同細胞和組織在各種試驗條件下進行比較[27-28]。近年來，隨著RACE和實時熒光定量PCR技術的發展與成熟，全長功能基因被克隆與分析，基因相對表達量的研究也越來越受到關注，隨之內參基因的研究也成為熱點研究對象，延伸因子EF1α是否能夠成為萼脊蘭生長發育和生理過程的內參標準，還需進一步研究。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Cloning and Sequence Analysis of GeneEF1αfromSedireajaponica

JIANG Suhua1, WANG Mofei1, SONG Caixia2, LIANG Fang1, LI Yanhui3, CUI Bo1*

(1.InstituteofBioengineering,ZhengzhouNormalCollege,Zhengzhou,Henan450044; 2.CollegeofLifeScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002; 3.FengqiuBureauofAgriculture,Xinxiang,Henan453300,China)

To explore geneEF1αin the process of growth and development, physiological functions and lay a foundation as internal genetic stability and applicability,EF1αofS.japonicawas cloned and sequence analyzed. According to the NCBI login plant translation elongation factor homologous conserved sequences of nucleotide primers to design degenerate primers,S.japonicaleaves as experimental materials, RNAprep pure plant kit was used to extract RNA, and use RT-PCR technology to clone the translation elongation factorEF1a. Through a series of bioinformatics analysis, the results showed that the gene sequence was 620 bp, encoding 206 amino acid residues, was a hydrophilic protein, molecular weight was 23.16 KD, isoelectric point was 8.50. Secondary structure analysis showed that the alpha helix occupied 29.61%, extended strand accounted for 31.55%, Random coil accounted for 38.83%. Subcellular located in cytoplasm. Protein sequence and phylogenetic analysis showed that it had high consistency and short evolutionary distance with theDoritaenopsishybrids of translation elongation factor protein. The authors registered them into GenBank (respective accession number: KT223116 ).

Sedireajaponica;EF1α; gene clone; secondary structure

2015-10-29； 2016-04-22修回

河南省科技攻關項目“蝴蝶蘭的分子育種”(092102110128)；鄭州市普通科技攻關項目“蝴蝶蘭新品種選育研究”(141PPTG G420)

蔣素華(1983-)，女，講師，碩士，從事花卉分子生物學研究。E-mail:jiangsuhua2006@163.com

*通訊作者：崔 波(1962-)，男，研究員，博士，從事花卉分子生物學研究。E-mail:laocuibo@163.com

1001-3601(2016)05-0189-0005-04

S685； Q789

A